尹 鵬，魏寶東

（沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110866）

雙重抗性篩選輔酶Q10高產菌株

尹 鵬，魏寶東*

（沈陽農業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110866）

以米曲霉（Aspergillus oryzae）Asp11為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變處理，以制霉菌素和維生素K3雙抗性為篩選標記，獲得制霉菌素抗性突變株Asp11-N006和制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株Asp11-N006-V01，其合成輔酶Q10的能力較出發(fā)菌株顯著提高。Asp11-N006和Asp11-N006-V01的輔酶Q10產量分別為28.27mg/L和38.46mg/L，較出發(fā)菌株分別提高了0.34倍和0.82倍，且遺傳性狀穩(wěn)定。

米曲霉，輔酶Q10，誘變，抗性篩選

輔酶Q10是生物體內廣泛存在的脂溶性醌類化合物，又稱泛醌、癸烯醌，它是呼吸鏈中NADH脫氫酶、Ain酸脫氫酶和維生素B-C復合物之間的脂溶性電子載體，是細胞能量代謝的生成要素[1-2]。作為與能量轉換有關的若干酶系統(tǒng)的輔助因子之一，它不僅是呼吸鏈上的氧化還原成分，更是生成ATP的必需輔酶[3]。輔酶Q10可與線粒體內膜相結合，在呼吸鏈中起載體作用；另外，因其醌式及側鏈異戊烯基結構等特點，還是重要遞氫體和細胞能量生成要素，并具有抗氧化和控制細胞內氧氣流動等性能，在生命體中發(fā)揮著重要的生理功能[4]。它不僅是細胞自身天然的抗氧化劑、細胞代謝的促進劑和呼吸的激活劑，對清除自由基及穩(wěn)定生物膜功能有著重要作用，還具有增強人體免疫功能、預防心臟病、保護肝臟和抗癌等作用[5]。因此，輔酶Q10在用于臨床治療疾病、提高免疫力和延緩人體衰老等方面有著不可代替的作用[6]。利用微生物發(fā)酵生產輔酶Q10是最具發(fā)展前途的生產方式。但是，有很多因素制約著發(fā)酵法工業(yè)化生產，而導致產量相對較低。其中，高產菌株的選育是目前發(fā)酵法生產輔酶Q10的研究關鍵。本實驗從篩選輔酶Q10高產菌株出發(fā)，以米曲霉為出發(fā)菌株，定向篩選得到抗性突變株，以期能有所突破，提高輔酶Q10產量。米曲霉作為發(fā)酵生產輔酶Q10的新菌種，在國內外尚未見到相關報道。因此，通過本研究，以期為工業(yè)化生產輔酶Q10提供新的實踐基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米曲霉（Aspergillus oryzae） 本院實驗室保存；斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（新鮮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH自然）；發(fā)酵培養(yǎng)基（%） 葡萄糖2.5、蔗糖2.5、蛋白胨1、酵母浸粉2、KH2PO40.1、K2HPO40.05、MgSO40.05，pH6.5；抗性培養(yǎng)基 采用PDA培養(yǎng)基，分別加入一定量的制霉菌素和維生素K3；輔酶Q10標準品 北京夏斯生物技術有限公司；制霉菌素、維生素K3美國Genview；其他試劑 均為分析純和生化試劑。

PB-10 pH計 Sartorius Co.Ltd；恒溫振蕩培養(yǎng)箱 北京沃德電子實驗設備廠；CT14RD臺式高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 取一支新鮮培養(yǎng)至孢子成熟的出發(fā)菌株試管斜面，加入5mL去離子水，輕輕振蕩試管，洗下斜面上的孢子，轉移至裝有10mL無菌水的三角瓶（內含玻璃珠）中，再加入5mL去離子水沖洗斜面，并一同轉入三角瓶，然后搖床振蕩30min以充分打散孢子團，最后通過血球計數(shù)板計數(shù)，調整孢子懸液的濃度為107個/mL。

1.2.2 制霉菌素和維生素K3最小抑制濃度的確定 在PDA培養(yǎng)基中分別添加質量濃度為70、80、90、100、110、120、130、140μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取0.2mL出發(fā)菌株制備的孢子懸液涂布于該抗性平板上，同時以未加制霉菌素的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況。

在PDA培養(yǎng)基中分別添加質量濃度為120、130、140、150、160、170μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，將誘變得到的抗性菌株Asp11－N006制備孢子懸液，取0.2mL涂布于該抗性平板上，確定最小抑制濃度。在確定該濃度之后，在PDA培養(yǎng)基中添加該濃度的制霉菌素，同時添加質量濃度為320、340、360、380、400、420、440、460μg/mL的維生素K3制成抗性平板，取0.2mL抗性菌株Asp11－N006制備的孢子懸液涂布于該平板，同時以未加維生素K3的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況。

1.2.3 紫外誘變 將20W的紫外燈開啟預熱20min，取5mL制備的孢子懸液于9cm的無菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下垂直距離30cm處邊磁力攪拌邊照射，照射時間為5min，然后在紅燈下吸取1mL紫外照射的孢子懸液適當稀釋，涂布平板進行抗性篩選，同時以未經照射的空白組為平行對照。

1.2.4 平板初篩 將誘變后的孢子懸液適當稀釋涂布于抗性平板上，30℃培養(yǎng)3～4d，挑取菌落生長快、孢子數(shù)量多的單菌落轉接入斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)后冷藏保藏，以備進一步搖瓶復篩。

1.2.5 搖瓶復篩 將初篩得到的抗性菌株按1.2.1的方法制備孢子懸液，調整濃度為109個/mL，然后按12%的接種量，直接將孢子懸液接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72h。離心收集菌體，測定輔酶Q10產量。

1.2.6 產物分離測定 利用堿醇皂化法[7]從菌體中提取輔酶Q10。采用薄層層析（TLC）分離濃縮發(fā)酵液中的輔酶Q10，并用紫外分光光度法[8]測定發(fā)酵液中輔酶Q10的產量。

2 結果與分析

2.1 米曲霉產輔酶Q10的確定

米曲霉為好氧型真菌，是重要且安全的工業(yè)發(fā)酵菌株[9]。將米曲霉作為出發(fā)菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，對其菌體的萃取液進行濃縮，并定容于1mL無水乙醇中進行薄層層析分離，結果見圖1。

由圖1可以看出，出發(fā)菌株粗提品經TLC（薄層層析）分離，在與輔酶Q10標準品色帶相同的Rf值處，也分離出了色帶，刮下標準品色帶和出發(fā)菌株粗提品色帶，分別定容于3mL無水乙醇中，在190～330nm波長范圍內進行紫外掃描，結果見圖2。

由圖2可以看出，出發(fā)菌株粗提品的紫外吸收峰型和輔酶Q10標準品的吸收峰型相一致，這說明米曲霉能合成輔酶Q10，其出發(fā)菌株的產量為21.09mg/L。

圖1 輔酶Q10標準品與出發(fā)菌株粗提品的薄層層析圖Fig.1 Thin－layer chromatogram of coenzyme Q10standard and the starting strains crude products

圖2 出發(fā)菌株粗提品的紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of starting strain crude products

2.2 制霉菌素抗性突變株的篩選

在PDA培養(yǎng)基中分別添加質量濃度為70、80、90、100、110、120、130、140μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取出發(fā)菌株制備的孢子懸液涂布于該抗性平板上，同時以未加制霉菌素的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長情況，見表1。

表1 制霉菌素對菌體生長的影響Table 1 Effect of nystatin on cell growth

通過表1可以確定制霉菌素的最小抑制濃度為130μg/mL，并以此濃度作為抗性篩選標記。出發(fā)菌株Asp11的孢子懸液經紫外誘變處理，適當稀釋后涂布于含制霉菌素濃度130μg/mL的抗性平板上，30℃培養(yǎng)3～4d，挑取生長良好的單菌落轉接于PDA斜面。再經搖瓶復篩，得到8株產量高于出發(fā)菌株25%的制霉菌素抗性菌株，見表2。其中，抗性菌株Asp11－N006的產量提高幅度最大，輔酶Q10產量為28.27mg/L，較出發(fā)菌株提高了0.34倍。再對該抗性菌株連續(xù)傳代十次，進行遺傳穩(wěn)定性實驗。結果顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，各代菌株輔酶Q10產量從28.27mg/L到27.06mg/L，產量無明顯減少，說明該突變株的性狀能穩(wěn)定遺傳。

表2 抗性菌株的輔酶Q10產量Table 2 The production of coenzyme Q10from resistant strains

結果表明，選育制霉菌素抗性突變株，可以在一定程度上提高輔酶Q10產量。推測原因，制霉菌素作為一種大環(huán)內酯類真菌抑制劑，能和真菌細胞膜中的麥角固醇結合，引起細胞膜損傷，從而使細胞膜的通透性增加。可能由于制霉菌素抗性突變株的細胞膜通透性發(fā)生改變，從而增加了菌體對營養(yǎng)物質的吸收，有利于進一步合成輔酶Q10。

2.3 制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株的篩選

在PDA培養(yǎng)基中分別添加質量濃度為120、130、140、150、160、170μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取上述誘變得到的抗性菌株Asp11－N006制備的孢子懸液涂布于該抗性平板上，同時以未加制霉菌素的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況，確定制霉菌素的最小抑制濃度，見表3。

在確定該濃度之后，在PDA培養(yǎng)基中添加該濃度的制霉菌素，同時添加質量濃度為320、340、360、380、400、420、440、460μg/mL的維生素K3制成雙重抗性平板，取抗性菌株Asp11－N006制備的孢子懸液涂布于該平板，同時以未加維生素K3的平板作為對照，30℃培養(yǎng)3～4d后觀察菌落的生長狀況，見表3。

表3 維生素K3對菌體生長的影響Table 3 Effect of Vitamin K3on strain growth

通過表3可以確定制霉菌素的最小抑制濃度為150μg/mL、維生素K3的最小抑制濃度為420μg/mL，并以此濃度作為抗性篩選標記。將抗性菌株Asp11－ N006的孢子懸液進行紫外誘變處理，適當稀釋后涂布于含制霉菌素濃度150μg/mL和維生素K3濃度420μg/mL的抗性平板上，30℃培養(yǎng)3～4d，挑取生長良好、孢子數(shù)量多的單菌落轉接于PDA斜面。再經搖瓶復篩，得到5株產量高于出發(fā)菌株50%的制霉菌素及維生素K3雙重抗性菌株，其中，抗性菌株Asp11－N006－V01的產量提高幅度最大，輔酶Q10產量為38.46mg/L，較抗性菌株Asp11－N006提高了0.36倍，較出發(fā)菌株提高了0.82倍。再對該抗性菌株連續(xù)傳代十次，進行遺傳穩(wěn)定性實驗。結果顯示，隨著傳代次數(shù)的增加，各代菌株輔酶Q10產量從38.46mg/L到37.23mg/L，產量無明顯減少，說明該突變株的性狀能穩(wěn)定遺傳。

結果表明，以制霉菌素抗性突變株為出發(fā)菌株，進一步篩選得到制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株，有利于進一步提高輔酶Q10產量。在輔酶Q10合成過程中可能存在終產物抑制，篩選抗結構類似物突變株可從遺傳角度解除微生物的正常代謝調控，有利于目的產物的合成。維生素K3是輔酶Q10的結構類似物，篩選出的突變株對維生素K3的耐受濃度提高，可能部分解除了終產物對參與輔酶Q10生物合成的有關酶的反饋抑制，從而提高了輔酶Q10的生物合成量。

2.4 抗性菌株產輔酶Q10的分離測定

圖3 輔酶Q10標準品與抗性菌株粗提品的薄層層析圖Fig.3 Thin－layer chromatogram of coenzyme Q10standard and resistant strains crude products

圖4 抗性菌株粗體品的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of resistant strain crude products

將上述篩選得到的抗性菌株Asp11－N006和Asp11－N006－V01進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結束后離心收集菌體，采用堿醇皂化法提取菌體中的輔酶Q10，將所得粗提品定容至1mL無水乙醇中，進行薄層層析分離（見圖3），定性測定輔酶Q10產量，并用紫外分光光度法定量測定發(fā)酵液中輔酶Q10的產量，結果見圖4和表4。

表4 抗性菌株的輔酶Q10產量Table 4 The production of coenzyme Q10from resistant strains

3 結論

3.1 米曲霉為好氧型微生物，通過TLC（薄層層析分離）說明，在其生長代謝過程中能夠合成輔酶Q10。

3.2 本實驗選取了兩個抗性篩選標記，通過紫外誘變選育到制霉菌素抗性突變株Asp11-N006和制霉菌素及維生素K3雙重抗性突變株Asp11-N006-V01，對該菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，其輔酶Q10產量分別為28.27mg/L和38.46mg/L。相較出發(fā)菌株而言，產輔酶Q10能力分別提高了0.34倍和0.82倍，為實現(xiàn)工業(yè)化生產奠定了一定的基礎。

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Screening coenzyme Q10high-yielding strain with double resistance screening label

YIN Peng，WEI Bao-dong*
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Aspergillus oryzae（Asp11）was used as the starting strain，through UV mutagenesis，obtained resistant mutants Asp11-N006 and Asp11-N006-V01 with double resistance of Nystatin and vitamin K3as screening label，and production of coenzyme Q10performance marked higher than the starting strain.The production of coenzyme Q10reached to 28.27mg/L and 38.46mg/L，improved into 0.34 times and 0.82 times by comparing with the starting strain.The mutant strains had stable genetic traits.

Aspergillus oryzae；coenzyme Q10；mutagenesis；resistance screening

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0150-04

2011－06－01 *通訊聯(lián)系人

尹鵬（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學。