劉 琪，江連洲，2，*，李 揚，2，王 梅，王勝男，齊寶坤

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030）

Protex 6L直接酶解紅豆粉提取紅豆肽的研究

劉 琪1，江連洲1，2，*，李 揚1，2，王 梅1，王勝男1，齊寶坤1

（1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030）

采用Protex 6L直接酶解紅豆粉的方法提取紅豆肽，通過響應曲面分析得出Protex 6L蛋白酶提取紅豆蛋白的最佳條件：pH為9.4，加酶量為3.14%，溫度為60℃，時間為3.5h，料液比為1∶6.9（g/mL）。并采用凝膠層析過濾色譜分析了不同水解時間水解物分子量的變化，發(fā)現(xiàn)紅豆蛋白中存在一些不容易被Protex 6L酶解的成分，紅豆粉的Protex 6L酶解過程是一個不均勻的過程。

Protex 6L，酶解，紅豆肽，響應面法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆 市售，粉碎后過80目篩，蛋白質20.7%、灰分3.3%、脂肪0.5%、碳水化合物58%、水分4.8%；Protex 6L（活力1.0×105U/mL） 丹麥Novo公司；Sephadex G-75 Fine Amersham Pharmacia Biotech公司；Bacitracin、Enkephalin、Angiotensin Sigma公司；牛血清白蛋白 海伯奧生物科技有限公司。

Z12-S9粉碎機 上海精科實業(yè)有限公司；LD4-2A離心機 北京醫(yī)用離心機廠；JJ-1精密電動攪拌機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；ALC310.3電子分析天平 北京賽多利儀器有限公司；pHS-25型酸度計 上海偉業(yè)儀器廠；DZKW-8-4電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；HYP消化爐、KDN-04B半自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗流程 紅豆→除雜→研磨→水分調節(jié)→粉碎60目過篩→調節(jié)溫度和pH→加酶水解→滅菌→離心分離→上清液加入等體積TCA→離心分離→上清液定氮

1.2.2 紅豆肽的酶解工藝[9]采用單因素實驗對加酶量、酶解溫度、酶解時間、料液比和酶解pH5個因素進行研究，確定各因素的最佳水平值范圍，再采用響應面中心組合實驗設計，研究各酶解參數(shù)對考察指標的影響規(guī)律。選取加酶量、酶解溫度、酶解時間、料液比和酶解pH5個因素為自變量，以多肽得率為響應值，優(yōu)化紅豆肽提取工藝的最佳參數(shù)。

1.2.3 多肽得率測定方法

式中：N1-在10%TCA中可溶性氮，mg；N2-原料紅豆中總氮，mg。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：Sephadex G-75 Fine凝膠柱；柱溫：室溫（約25℃）；流速：0.5mL/min；進樣量：2%的紅豆蛋白和肽混合液為2mL，流動相：70%；檢測器：waters486紫外檢測器；色譜儀：waters 650蛋白質純化系統(tǒng)，檢測波長為280nm。

2 結果與分析

2.1 Protex 6L水解條件對紅豆肽得率的影響

2.1.1 加酶量對多肽得率的影響 由圖1可知，在一定范圍內，隨著加酶量的增加，多肽得率升高，當加酶量到達2%時，多肽得率接近最大值，但超過2%時，多肽得率趨于穩(wěn)定。原因主要為酶量增加，酶與底物作用得越充分，蛋白酶對蛋白質的分解作用越大，從而有利于多肽的產(chǎn)生。因此，最佳的加酶量為2%。

圖1 加酶量對多肽得率的影響Fig.1 Effect of enzyme additive amount of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.2 酶解溫度對多肽得率的影響 如圖2所示，在低于60℃時，多肽得率隨著溫度的升高而增加，當溫度高于60℃時，多肽得率隨著溫度的升高而降低，因為此后溫度將超過酶的最適溫度，酶活性降低，高溫會使堿性蛋白酶變性，部分或全部失去催化活性[10]，因此最適溫度為60~65℃。

圖2 溫度對多肽得率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.3 酶解時間對多肽得率的影響 如圖3所示，當時間低于3.5h時，多肽得率大幅上升，變化程度較明顯，隨著時間的延長，多肽得率變化程度不明顯。說明隨著時間的延長，底物不斷減少，酶解充分。因此最適合的酶解時間為3.5~4h。

圖3 酶解時間對多肽得率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.4 料液比對多肽得率的影響 如圖4可知，隨著料液比的降低或底物濃度的升高，蛋白得率先升高而后緩慢下降，在1∶7時最高。酶法提取紅豆肽的過程中適量的水對酶解具有積極的意義，但水過量時，酶反應體系中酶濃度和底物濃度低，使酶分子與底物分子碰撞的幾率降低，酶作用效果降低；水量過低，則料液黏度太大，影響了酶和底物的流動，也降低了酶作用效果[11]。因此在響應面實驗設計中料液比選擇1∶6～1∶8。

圖4 料液比對多肽得率的影響Fig.4 Effect of solid to liquid of hydrolysis on polypeptides recovery

2.1.5 pH對多肽得率的影響 如圖5可知，隨著pH的增加，多肽得率逐漸增加，當pH為8~9時，多肽得率最高，而后隨著pH的增加，多肽得率逐漸降低。主要的原因是實驗用堿性蛋白酶的最適pH接近9，pH在9附近時，酶活高，酶對底物作用的效果明顯，多肽提取率高；反之，多肽得率低[12]。因此最適的pH為9。

圖5 酶解pH對多肽得率的影響Fig.5 Effect of materials to pH water rate of hydrolysis on polypeptides recovery

2.2 Protex 6L酶解工藝條件的響應面實驗結果

2.2.1 實驗設計的因素與水平 以酶解溫度、酶解時間、料液比、pH、加酶量為自變量，以單因素實驗所得紅豆多肽得率為響應值（y），采用響應面分析法在五因素五水平上對酶解過程進行優(yōu)化，以達到最大限度提取紅豆多肽的目的。實驗設計及結果見表1和表2。

表1 響應面優(yōu)化實驗因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

2.2.2 回歸模型的建立和方差分析 采用SAS軟件對響應值與各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程[13]：

y=81.154+6.35x1+3.66x2-2.32x4-4.59x12+2.29x1x2+ 5.82x1x4-9.16x22+12.57x2x3+1.07x2x5-5.07x32-11.43x42+ 0.073x4x5-1.74x52

表3和表4可看出，該回歸方程的一次項和二次項非常顯著，說明各個實驗因素對響應值的影響是二次拋物線的關系。整體模型的“Pr＞F”值小于0.05，表明該二次方程模型比較顯著；R2=0.9818，說明這種實驗方法是可靠的，能夠很好地描述實驗結果，使用該方程進行真實的實驗點分析是可行的?；貧w系數(shù)顯著性檢驗表明，在所選取的各因素水平范圍內，對Protest 6L酶解紅豆粉影響的排序依次為：酶解pH＞加酶量＞酶解時間＞酶解溫度＞料液比。

2.2.3 響應因子水平的優(yōu)化 由圖2的響應面可看出x1、x2、x3、x4、x5存在極值點，對y進行嶺脊分析[14]，分析可知，5個因素的最優(yōu)實驗點（x1、x2、x3、x4、x5）代碼值（0.87597、0.27994、-0.03184、0.11656、-0.14947）即（9.4380、3.1400、59.8408、3.5291、6.9253），根據(jù)實驗的實際情況，5個因素的最優(yōu)取值為9.4、3.14、60、3.5、料液比為1∶6.9，此時y取最大值84.29%。也可用擬合的二次方程分別對x1、x2、x3、x4、x5求偏導，得出方程組，然后解方程組，分別求出x1、x2、x3、x4、x5和y。此方法比較繁瑣且得出的結果可能是響應面的鞍點，并不一定是極值點。在以上優(yōu)化的穩(wěn)定點進行3次驗證實驗，證明預測值84.51%與實驗平均值84.29%是非常接近的。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Experiment design and results

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 回歸系數(shù)取值及分析結果Table 4 Value of regression coefficient and analysis results

圖6 各酶解參數(shù)交互顯著項對多肽得率的響應面分析Fig.6 Response surface analysis of significant effective interaction items of different hydrolysis parameters on polypeptides recovery

2.3 紅豆粉水解過程中分子量變化與紅豆肽釋放關系探討

通過以上研究發(fā)現(xiàn)，水酶法提取紅豆肽過程中，蛋白質的水解狀態(tài)對紅豆肽的影響很大。將已知分子量的標準品[a牛血清白蛋白（分子量65982u）、b卵白蛋白（分子量43988u）、c胰蛋白酶（分子量20994u）、d溶菌酶（分子量13996u）和e胰島素（分子量5499u）]分別稱取20mg溶解于3mL pH為8的磷酸鹽緩沖溶液中。將5種配制好的蛋白質標準品溶液混合振蕩均勻后，抽取混合液1mL加樣到SephadexG-75，在280nm分別檢測蛋白質吸光值。根據(jù)標準品分子量對數(shù)與保留時間關系建立線性方程[15]（見圖7）。

采用最小二乘法求出直線的回歸方程為：y= -0.0821x+6.4726，R2=0.9883，式中：x代表保留時間，y代表分子量對數(shù)。采用該回歸方程可以根據(jù)某蛋白的保留時間估算出該物質的分子量。

圖7 分子量對數(shù)與保留時間的關系Fig.7 Logarithm of molecular weight as a function of elution time

在最佳酶解工藝條件（pH為9.4，加酶量為3.14%，溫度為60℃，時間為3.5h，料液比為1∶6.9）下，按照不同水解時間取樣品噴霧干燥。分別稱取噴霧干燥后粉末20mg溶解于3mL pH為8的磷酸鹽緩沖溶液中。將待測樣品混合振蕩均勻后，抽取1mL經(jīng)0.22μm微濾膜過濾后，加樣到SephadexG-75檢測蛋白質吸光值（見圖8）。

圖8 紅豆的Protex 6L酶水解產(chǎn)物SephadexG-75凝膠洗脫圖譜Fig.8 SephadexG-75 gel elution spectrum of red bean hydrolysate by Protex 6L

由圖8可以看出洗脫譜圖的排阻時間位置，根據(jù)圖7分子量對數(shù)與保留時間關系的線性方程換算出各峰的分子量分布發(fā)現(xiàn)，先出現(xiàn)的峰為分子量大于100000u的蛋白質，后出現(xiàn)的一系列峰為分子量小于40000u的肽，由此可知水解時間對樣品分子量分布的影響規(guī)律，結果見表5。

由圖8可知，水解過程中紅豆蛋白分子量的變化是一個漸進的過程，紅豆蛋白經(jīng)過從眎到胨，最后變成小肽。由圖8和表5可知，隨著水解度的逐漸增大，樣品中分子量小于40000u的肽的百分比逐漸增大，但在水解大于4h后略有波動，分析由于水解4h后一部分未能通過0.22μm微濾膜的蛋白被水解，導致大于100000u的百分比增加，而在水解4.5h后該部分蛋白進一步水解為肽。從圖8還可以看到洗脫譜圖中始終存在分子量大于100000u的高峰，說明紅豆蛋白中始終存在一些不容易被水解的蛋白成分，而且紅豆蛋白的水解過程是不均勻的。

表5 酶解時間與水解蛋白分子量分布的關系Table 5 Protein molecular distribution as a function of hydrolysis time

3 結論

3.1 利用響應面分析方法對水酶法提取紅豆蛋白的酶解工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，得到了最優(yōu)酶解工藝條件為：pH9.4，加酶量3.14%，溫度60℃，時間3.5h，料液比1∶6.9。此酶解工藝條件下多肽得率可達到84.29%左右。

3.2 紅豆的水解是不均勻的過程，采用Protex 6L水解4.5h后，凝膠過濾層析結果顯示水解物中仍然含有大量的大分子肽，說明紅豆蛋白中始終存在一些不容易被水解的蛋白成分。

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Study on enzymolysis extraction of red bean peptide from red bean powder by Protex 6L

LIU Qi1，JIANG Lian-zhou1，2，*，LI Yang1，2，WANG Mei1，WANG Sheng-nan1，QI Bao-kun1
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China）

The red bean peptide was extracted from red bean by the aqueous enzymatic method using Protex 6L.The results showed that optimum conditions with response surface analysis were：enzyme amount 3.14%，hydrolysis temperature 60℃，enzymolysis time 3.5h，the ratio of solid to liquid 1∶6.9，pH9.4.The molecular masses of the hydrolysates were determined with Sephadex G-75 gel filtration chromatography.It showed that red bean contained some stable components which were difficult to hydrolyze with Protex 6L and the process of red bean hydrolysis was disproportional.

Protex 6L；enzymolysis；red bean peptide；response surface experiment

TS201.2

A

1002-0306（2012）07-0191-05

赤豆，又稱小豆、赤小豆、紅豆，為豆科植物赤小豆或是赤豆干燥成熟的種子，其色澤為鮮紅、淡紅或深紅[1]。赤豆中蛋白質含量平均為22.65%，比禾谷類蛋白質含量高2~3倍，氨基酸種類齊全，含有人類必需的8種氨基酸[2]，營養(yǎng)價值較高。紅豆除營養(yǎng)價值外還有較高的藥用價值，王彤等人[3]發(fā)現(xiàn)食用赤豆對餐后血糖穩(wěn)定能力優(yōu)于饅頭、眉豆、綠豆，可以作為糖尿病人食用的較為理想的主食之一。代卉等[4]研究了Alcalase水解小麥蛋白制備的肽的抗氧化活性。任海偉等[5]利用堿性蛋白酶與中性蛋白酶對黑豆蛋白進行酶解制備抗氧化肽。林燕等[6]利用木瓜蛋白酶酶解核桃分離蛋白制備小分子活性肽，并對不同分子量段核桃多肽的抗氧化性進行了研究。王永剛等[7]以蕓豆蛋白為原料研究蕓豆抗氧化活性肽的酶解工藝。孫國威等[8]選擇堿性蛋白酶和中性蛋白酶對大豆7S、11S蛋白進行模擬水解，得到不同水平的抗氧化肽肽段，以重均分子量為手段，評價理論模擬與實驗水解的相關性。而目前對于利用Protest 6L直接酶解紅豆粉方面的研究報道較少，本實驗以紅豆粉作為原料，對其酶解條件進行研究，得出了Protex 6L酶解提取紅豆肽的最佳參數(shù)。

2011－07－12 *通訊聯(lián)系人

劉琪（1989－），在讀研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。

黑龍江省攻關項目（GA09B401-6）；農業(yè)部現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設項目（nycytx-004）。