楊 林，于愛紅，邵文斌，林 鵬，錢嬌玲

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

大火草總黃酮超聲提取工藝研究

楊 林，于愛紅*，邵文斌，林 鵬，錢嬌玲

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

目的：采用超聲波輔助技術(shù)提高大火草中黃酮提取率。方法：采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)法，以大火草總黃酮提取率為指標(biāo)，確定最佳提取工藝條件。結(jié)果：最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%、料液比1∶50、超聲功率90W、超聲時(shí)間80min、提取3次，在該工藝條件下，總黃酮提取率為1.474%。結(jié)論：該提取工藝簡(jiǎn)單可行，適用于大火草總黃酮的提取。

大火草，總黃酮，超聲提取，紫外分光光度法

大火草（Anemone tomentosa（Maxim.）Pei）系毛茛科銀蓮花屬多年生草本植物，在我國(guó)主要分布在西南、西北、華北及華中地區(qū)，生于山地草坡[1]。大火草根狀莖入藥：性溫、味苦，具有化痰、散瘀、消食化積、截瘧、解毒、殺蟲等功效[1]。目前，只見少量有關(guān)大火草化學(xué)成分分離和形態(tài)、顯微方面的研究報(bào)道[2]。關(guān)于大火草黃酮類成分的研究幾乎為空白。本文采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)方法，研究超聲波法[3-4]提取大火草總黃酮的提取工藝，為大火草生物活性、活性部位、活性成分等的研究，以及大火草植物資源的開發(fā)利用等的進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)支持，為大火草產(chǎn)品的開發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大火草根 采自甘肅省舟曲縣茶崗林場(chǎng)，經(jīng)蘭州理工大學(xué)楊林老師鑒定為毛茛科銀蓮花屬植物大火草（Anemone tomentosa）的根；蘆丁對(duì)照品 95%，南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所；NaNO2汕頭市西隴化工廠有限公司；Al（NO3）3汕頭市西隴化工廠有限公司；NaOH 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙醇 天津市百世化工有限公司，以上試劑均為分析純。

AB-105N電子天平 Mettler Toledo Group；Cary-50 probe紫外分光光度計(jì) Varian Australia RTY LTD；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 100W，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZF-6020型真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大火草總黃酮提取液的制備 準(zhǔn)確稱取粉碎后的大火草根狀莖樣品（1.000g），加入75%乙醇40mL，超聲功率為100W，50℃水浴超聲提取60min，取出，抽濾后冷卻至室溫，濾液置于250mL容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。

1.2.2 大火草總黃酮的定性分析[5-6]

1.2.2.1 鹽酸-鎂粉反應(yīng) 取1mL供試液于試管中，加鎂粉適量，搖勻，加2～5滴濃鹽酸，即產(chǎn)生劇烈反應(yīng)。溶液呈紅色或紫紅色，表明可能含有黃酮類化合物。

1.2.2.2 三氯化鋁反應(yīng) 取供試液點(diǎn)于濾紙上，晾干，噴霧三氯化鋁試劑，干燥后，斑點(diǎn)呈鮮黃色，在紫外燈下觀察，斑點(diǎn)有明顯的黃綠色熒光，表明可能含有黃酮類化合物。

1.2.2.3 氨熏反應(yīng) 取供試液滴于濾紙上，置氨氣中熏片刻，斑點(diǎn)呈亮黃色，在紫外燈下觀察，斑點(diǎn)呈黃色熒光，表明可能含有黃酮類化合物。

1.2.2.4 堿液實(shí)驗(yàn) 取供試液點(diǎn)于濾紙片上（干后，重復(fù)點(diǎn)樣，使其溶液集中），干后，噴1%碳酸鈉溶液或在氨蒸氣中熏幾分鐘，呈現(xiàn)亮黃、綠或橙黃色。將氨氣熏過的濾紙露置空氣中，顏色逐漸褪去而變?yōu)樵械念伾锰妓徕c水溶液處理后置空氣中不褪色，表明可能含有黃酮或其苷類。

1.2.3 樣品溶液的含量測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備[7]準(zhǔn)確稱取蘆丁對(duì)照品9.5mg，加75%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，搖勻，即為0.190mg/mL的對(duì)照品溶液。分別吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5mL于10mL容量瓶中，再分別加入0.3mL 5%NaNO2搖勻，放置6min后加入0.3mL 10%Al（NO3）3，搖勻，6min后再加入4mL 4% NaOH溶液，混勻，加75%乙醇至刻度，放置15min，以第一瓶為空白，按分光光度法，在510nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 樣品總黃酮含量測(cè)定方法 精密量取“1.2.1項(xiàng)”中所得總黃酮供試液1mL至10mL容量瓶中，按“1.2.3.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程結(jié)合下式計(jì)算提取率：

式中：W為樣品質(zhì)量（mg），X為樣品中黃酮濃度（mg/mL），V為最初定容體積（mL）。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響 精確稱取干燥大火草根粗粉（2.0000g）5份（n=3），分別用濃度為40%、50%、60%、70%、80%乙醇各80mL，在50℃，100W條件下水浴超聲提取60min，過濾，冷卻，按照“樣品總黃酮含量測(cè)定方法”測(cè)定并換算總黃酮含量。

1.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響 精確稱取干燥大火草根粗粉（2.0000g）5份（n=3），在乙醇濃度60%，料液比1∶40，溫度50℃，功率100W條件下，水浴超聲提取20、40、60、80、100min，過濾，冷卻，按照“樣品總黃酮含量測(cè)定方法”測(cè)定并換算總黃酮含量。

1.3.3 料液比對(duì)提取效果的影響 精確稱取干燥大火草根粗粉（2.0000g）5份（n=3），在乙醇濃度60%，溫度50℃，功率100W條件下，料液比（g/mL）設(shè)定為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，提取80min，過濾，冷卻，按照“樣品總黃酮含量測(cè)定方法”測(cè)定并換算總黃酮含量。

1.3.4 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響 精確稱取干燥大火草根粗粉（2.0000g）4份（n=3），在乙醇濃度60%，料液比1∶50，溫度50℃，功率100W條件下，提取次數(shù)設(shè)定為4個(gè)水平：1、2、3、4次，提取80min，過濾，冷卻，按照“樣品總黃酮含量測(cè)定方法”測(cè)定并換算總黃酮含量。

1.3.5 超聲功率對(duì)提取效果的影響 精確稱取干燥大火草根粗粉（2.0000g）4份（n=3），在乙醇濃度60%，料液比1∶50，超聲溫度為50℃的條件下，超聲功率設(shè)定為5個(gè)水平：60、70、80、90、100W，提取80min，過濾，冷卻，按照“樣品總黃酮含量測(cè)定方法”測(cè)定并換算總黃酮含量。

1.4 正交實(shí)驗(yàn)[8]

通過單因素實(shí)驗(yàn)分別探討了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)以及超聲功率對(duì)大火草總黃酮提取率的影響，并確定了各實(shí)驗(yàn)因素的最佳水平?？紤]到各因素間可能的相互依賴和相互制約會(huì)對(duì)黃酮提取率造成一定的影響，為得到理想的超聲環(huán)境下大火草黃酮提取工藝，通過正交實(shí)驗(yàn)確定各參數(shù)的最佳組合。經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)，不同的超聲功率對(duì)大火草黃酮的提取率沒有較明顯的影響，實(shí)驗(yàn)以L9（34）正交表設(shè)計(jì)，4因素分別為單因素實(shí)驗(yàn)中所研究的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)，水平設(shè)計(jì)以單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)因素水平表。

2 結(jié)果與討論

2.1 大火草總黃酮定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

“1.2.2”項(xiàng)下定性實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明大火草根狀莖中含有黃酮類化合物。

2.2 大火草總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)，按分光光度法（中國(guó)藥典2005版一部附錄VA），在510nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度。以蘆丁的濃度x（mg/mL）對(duì)吸收度A進(jìn)行回歸，得回歸方程為：A=8.548x－0.0045（R=0.9998）。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9-10]

2.3.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響 可用于提取黃酮類化合物的溶劑很多，主要為甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、水或某些極性較大的混合溶劑等，從溶劑的安全性和成本等考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇用乙醇做提取劑。由于黃酮類化合物種類復(fù)雜，不同濃度的乙醇對(duì)黃酮類化合物的溶解性能不盡相同，因此不同濃度乙醇對(duì)總黃酮提取也有不同的影響。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，乙醇濃度從40%升至60%，總黃酮提取率隨之增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，黃酮提取率達(dá)到頂峰，乙醇濃度超過60%后，提取率驟然下降。因此，確定最佳提取溶劑為60%的乙醇。如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，提取時(shí)間在20～80min范圍內(nèi)，總黃酮提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為80min時(shí)，達(dá)到最大值，80min以后，總黃酮提取率驟然下降。這是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間范圍內(nèi)，超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，使細(xì)胞破裂，促進(jìn)黃酮類化合物的釋放和溶出，有助于溶質(zhì)的擴(kuò)散，從而提高了提取率，直至溶液中黃酮濃度達(dá)到最大值。但隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)使溫度升高，當(dāng)溫度達(dá)到一定限度時(shí)，會(huì)使黃酮的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而被降解[11]，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，雜質(zhì)的含量會(huì)增加，不利于純化過程。因此，選擇最佳提取時(shí)間為80min。如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction

2.3.3 料液比對(duì)提取率的影響 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，料液比從1∶20到1∶50時(shí)，總黃酮提取率顯著增加。料液比是1∶50時(shí)，提取率達(dá)到最大值。但是當(dāng)料液比超過1∶50時(shí)，總黃酮提取率明顯下降。這是由于料液較低時(shí)，溶液濃度較高，黃酮類化合物提取不完全，而料液比過高時(shí)，溶劑的回收時(shí)間過長(zhǎng)，反而造成了其中黃酮類化合物的損失，因此考慮到提取成本等因素，選擇1∶50為最佳料液比。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of solid/liquid on the extraction

2.3.4 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，大火草根總黃酮提取率隨提取次數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取次數(shù)高于3次時(shí)，大火草總黃酮基本提取完全，提取率趨于平穩(wěn)，考慮到提取成本，選擇提取次數(shù)為3次。如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on the extraction

2.3.5 超聲功率對(duì)提取率的影響 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，隨著超聲功率的增加，大火草總黃酮提取率先增后減，當(dāng)超聲功率為90W時(shí)，總黃酮提取率最高。這是因?yàn)殡S著超聲功率的增加，有利于細(xì)胞破裂，促進(jìn)黃酮類化合物向溶媒中溶解，提高了提取率，當(dāng)超聲功率為90W時(shí)，黃酮已基本提取完全，溶液體系的滲透壓達(dá)到平衡，功率再增加，樣品顆粒會(huì)不斷縮小，則造成對(duì)黃酮類化合物的吸附[12]，并且超聲功率過大可能會(huì)破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，也會(huì)造成總黃酮含量的下降。所以選擇最佳超聲功率是90W，但其對(duì)大火草總黃酮提取率影響不顯著。如圖5所示。

圖5 超聲功率對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以上討論了各單因素的影響，在實(shí)際操作中各因素是相互影響的。為全面考察影響因素，設(shè)計(jì)了4因素3水平L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（表1），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交實(shí)驗(yàn)表Table 2 Results of orthogonal experiments

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在超聲提取過程中，乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)，這四個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率均有一定影響，影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間。乙醇濃度的影響是最顯著的，最優(yōu)的提取方案為A2B2C2D3，即乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為80min，料液比為1∶50，提取次數(shù)為3次。

2.5 最佳工藝驗(yàn)證

準(zhǔn)確稱取大火草根狀莖粗粉三份，每份1.000g，按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取方案A2B2C2D3，即乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為80min，料液比為1∶50，提取次數(shù)為3次，超聲功率為90W，用“1.2.3.1”項(xiàng)下的方法測(cè)定大火草根總黃酮的提取率，所得的總黃酮提取率分別為1.471%、1.477%和1.473%（均值為1.474%），比正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的較優(yōu)組1.354%高，表明此正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取工藝符合實(shí)際。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定了超聲波法提取大火草根總黃酮最佳工藝為：乙醇濃度60%，提取時(shí)間80min，料液比1∶50，提取次數(shù)3次，超聲功率90W。但該工藝并非各單因素實(shí)驗(yàn)中所確定最佳水平的簡(jiǎn)單組合，說明不同因素間可能存在一定的相互作用。在以上提取工藝條件下測(cè)得的總黃酮提取率高達(dá)1.474%。該工藝簡(jiǎn)單可行，適合于大火草黃酮類化合物的提取。

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Study on ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Anemone tomentosa

YANG Lin，YU Ai-hong*，SHAO Wen-bin，LIN Peng，QIAN Jiao-ling
（College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

Objective：The experiment adopted ultrasonic-assisted technology to improve extraction rate of total flavonoids from Anemone tomentosa.Methods：On the base of the single factor test and orthogonal experiment，in order to obtain the optional technology conditions of extraction rate of flavonoids.Results：The optimal technology conditions were as follows：The concentration of ethanol was 60%，solid liquid ratio was 1∶50，power of ultrasonic instrument 90W，extraction for 80min，extracting times was 3.The extraction rate of flavonoids from Anemone tomentosa was 1.474%under the optimal extraction technology.Conclusion：The optimum process was reasonable and feasible.

Anemone tomentosa；total flavonoids；ultrasonic extraction；ultraviolet spectrophotometry

TS201.1

B

1002-0306（2012）07-0244-04

2011－07－04 *通訊聯(lián)系人

楊林（1974-），男，博士，副教授，主要從事中藥新藥、化學(xué)新藥的研究開發(fā)。

甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃（0916RJZA007）。