熊建飛，周光明，何 強，許 麗，張 磊，吳利敏

（1.西南大學化學化工學院，發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室，重慶400715；2.重慶大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶400045）

離子色譜法測定玄參中的單糖和低聚寡糖

熊建飛1，周光明1，何 強2，*，許 麗1，張 磊1，吳利敏1

（1.西南大學化學化工學院，發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室，重慶400715；2.重慶大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶400045）

建立陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定玄參中的葡萄糖、蔗糖、果糖和水蘇糖的方法。以METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）陰離子交換柱為分離柱，脈沖安培檢測，30mmol/L NaOH溶液為淋洗液等度洗脫，超聲水提法提取玄參中的糖。峰面積的相對標準偏差為0.56%～9.01%，線性范圍1～50mg/L，檢出限為0.0452～0.0921mg/L，相關(guān)系數(shù)R為0.9931～0.9998，加標回收率在96.52%～109.56%之間。該方法預(yù)處理簡單，準確度高，適用于快速測定玄參中的單糖和低聚寡糖。

陰離子交換，脈沖安培，等度洗脫，超聲水提，玄參，單糖，低聚寡糖

玄參為玄參科，玄參屬植物的干燥根，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效。玄參中含有多種成分，如有機酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、甾醇、揮發(fā)油、糖類等[1]。玄參中的糖類主要為單糖和低聚寡糖，胡禮勇等人[2]從玄參中分離得到一種四糖，并經(jīng)核磁共振譜圖分析鑒定為水蘇糖。水蘇糖是天然存在的一種四糖，具有多種生理功能：能夠促進體內(nèi)有益菌增殖，改善消化道內(nèi)環(huán)境；調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂，促進腸道對鈣、鎂等微量元素的吸收[3]；在防癌、抗癌、抗衰老等方面也有重要作用。目前，關(guān)于中草藥的化學成分研究大多集中在酮類、苷類、萜類、有機酸、甾醇、脂類等[4-7]，而糖類化合物的研究大多數(shù)是多糖類物質(zhì)[8]，單糖和低聚寡糖的研究相對較少，因此測定玄參中單糖和低聚寡糖，尤其是水蘇糖的含量，可為進一步開發(fā)利用玄參提供參考依據(jù)。測定糖的方法主要有毛細管電泳色譜法[9]、氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11]等，它們大多有需要衍生化處理或靈敏度低等缺陷。離子色譜法測定糖，樣品前處理簡單，無需衍生，且靈敏度高。糖能夠在堿性環(huán)境中解離成陰離子，能夠用陰離子交換柱進行分離，在pH≥12的環(huán)境中糖能夠在電極上發(fā)生氧化還原反應(yīng)，可以用脈沖安培檢測器檢測。離子色譜法測定的糖一般是單糖和二糖，而四糖的測定則較為少見。四糖的保留能力較強，往往需要在淋洗液中添加NaAc來減弱它的保留能力，有時還需要梯度洗脫[12]，從而增加了實驗的復雜程度；而等度洗脫法避免了這些復雜的步驟，簡化了測定過程。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖（分析純）、蔗糖、果糖（生化試劑） 成都市科龍化工有限公司；水蘇糖 分析純，Sigma公司；NaOH 分析純，重慶川東化工有限公司；玄參 購于本地中藥房；超純水。

（Metrohm）861 Advanced Compact IC、METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）陰離子交換柱、脈沖安培檢測器、IC-Net 2.3色譜工作站 瑞士萬通公司；電子天平 上海精天電子儀器有限公司；隔膜真空泵 天津市騰達過濾器件廠；超聲波清洗器 上海必能信超聲波有限公司；布氏漏斗，0.45μm微孔濾膜。

1.2 色譜條件

METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）陰離子交換柱，脈沖安培檢測，淋洗液30mmol/L NaOH溶液，柱溫32℃，流速1.0mL/min，再生液200mmol/L NaOH溶液，加標定性，外標法峰面積定量。

1.3 標準溶液和淋洗液的配制

1.3.1 標準溶液的配制 分別精密稱取葡萄糖、蔗糖、果糖0.1000g，放入100mL容量瓶中，加入20mL去離子水，攪拌溶解置入100mL容量瓶中定容至刻度，配成1000mg/L作為儲備液；稱取水蘇糖0.0050g，放入100mL容量瓶中，配成50mg/L作為儲備液。

1.3.2 淋洗液的配制 準確稱取8.0g NaOH固體于100mL容量瓶中溶解，轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中定容，配成200mg/L的NaOH溶液作為再生液。同樣的方法稱取1.2g NaOH固體溶解后，轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中定容，配制成30mg/L的NaOH溶液作為淋洗液。

1.4 樣品前處理

中草藥的化學成分較為復雜，常規(guī)方法難以達到理想的提取效果，近年來發(fā)展起來的超聲波提取技術(shù)是一種較為理想的提取方法。超聲波能夠破壞細胞結(jié)構(gòu)，使其在瞬間破裂，使有效成分得以釋放，提高了提取效率[13]。糖類化合物具有較好的水溶性，可以用水作提取溶劑，因此本實驗采用超聲水提法提取玄參中的糖。

將玄參切碎，稱取0.1g，放入100mL小燒杯中，加入20mL去離子水，室溫超聲10min，用布氏漏斗過濾，將濾液定容至100mL，0.45μm微膜濾紙過濾，取濾液10mL于100mL容量瓶中定容，進樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 淋洗液濃度、柱溫和流速的選擇

實驗分別考察了5、10、15、20、25、30、35、40、50mmol/L NaOH溶液對分離度的影響，結(jié)果表明當NaOH溶液的濃度低于20mmol/L時，峰的分離度較差，隨著淋洗液濃度的增大，峰形逐漸變好，當濃度為30mmol/L時，各個峰分離度較好，大于30mmol/L時果糖與水蘇糖分離度變差。因此本實驗選擇30mmol/L NaOH溶液為淋洗液。

分別設(shè)定柱溫為20、25、30、32、40℃，實驗結(jié)果表明，降低溫度峰的分離度稍有改變，峰形較好，但柱壓逐漸增大，隨著溫度的升高分離度變差，綜合考慮選擇柱溫為32℃。

分別設(shè)定流速為0.5、0.8、1.0、1.2、1.6mL/min，實驗結(jié)果表明，改變流速對分離度的影響很小，隨著流速的增大保留時間縮短，但柱壓升高，為了保護色譜柱和縮短分離時間，選擇1.0mL/min為流速。

在以上優(yōu)化好的條件下，測得10mg/L混合標準溶液的譜圖，橫坐標為保留時間（min），縱坐標為峰高（nA），如圖1所示。

圖1 4種糖的標準色譜圖Fig.1 Standards chromatography of 4 kinds of monosaccharides

2.2 精密度的測定

將10mg/L的標準溶液連續(xù)5次進樣，分別計算峰高、峰面積的相對標準偏差（RSD）。計算結(jié)果如表1所示，由表1可知保留時間和峰高的相對標準偏差較大，而峰面積的相對標準偏差較小，因此本實驗采用加標定性法進行定性分析，采用外標法對峰面積定量。

表1 相對標準偏差RSD測定結(jié)果（%）Table 1 The results of relative standard deviation（%）

2.3 超聲時間的選擇

圖2 提取率與超聲時間的關(guān)系Fig.2 Effect of ultrasonoscope on extraction rate

表2 線性方程、線性范圍和儀器檢出限Table 2 Linear regression equations，linear ranges and detection limits

稱取0.1g樣品6份，按1.4中樣品處理方法進行樣品前處理，分別超聲5、10、15、20、25、30min。超聲時間對糖提取效率的影響如圖2、圖3所示，橫坐標為超聲提取時間（min），縱坐標為提取率（質(zhì)量分數(shù)%）。由圖2、圖3可知，提取時間對葡萄糖、蔗糖、果糖提取率的影響較大，對水蘇糖影響較小，隨著超聲時間的延長，水蘇糖的提取率略有下降。實驗發(fā)現(xiàn)，超聲時間越長，溶液雜質(zhì)越多，使得過濾時間延長，因此本實驗選擇超聲時間為10min。

2.4 標準曲線的繪制和儀器檢出限的計算

分別配制1、3、5、10、30、50mg/L葡萄糖、蔗糖、果糖和水蘇糖的混合標準溶液。分別測定六個混合標準溶液，Y為峰面積，X為濃度，繪制標準曲線，根據(jù)S/N=3計算儀器檢出限，結(jié)果如表2所示。

2.5 樣品測定結(jié)果

取玄參樣品5份，分別編號為1、2、3、4、5，按照1.4中樣品處理方法對樣品進行前處理，按1.2中色譜條件進行測定，樣品色譜圖如圖4所示，橫坐標為保留時間（min），縱坐標為峰高（nA）。測定結(jié)果如表3所示，由表3可知，不同部位的玄參根中糖的含量有少許差距。

表3 樣品測定結(jié)果（質(zhì)量分數(shù)%）Table 3 The results of the samples（mass fraction%）

圖3 樣品色譜圖Fig.3 Standards chromatography of sample

2.6 加標回收率

同時稱取兩份樣品0.1012g，其中一份加入標準物質(zhì)，按照1.4樣品處理方法對樣品進行處理，測得加標回收率如表4所示。

表4 加標回收率Table 4 The results of recovery percentage

3 結(jié)論

實驗測得玄參中水蘇糖的平均含量為9.37%，含量較高，因此玄參可以作為提取水蘇糖的一種原料。水蘇糖可以從玄參中被分離純化，進而制成一種中成藥，以提高玄參的藥用價值。果糖與水蘇糖的分離度不是很好，可能是二者在所選用的陰離子交換柱上具有較強相互作用引起的。

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Determination of monosaccharides and oligosaccharides in figwort root by ion chromatography

XIONG Jian-fei1，ZHOU Guang-ming1，HE Qiang2，*，XU Li1，ZHANG Lei1，WU Li-min1
（1.Key Laboratory on Luminescence and Real-Time Analysis（Southwest University），Ministry of Education，School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715，China；2.Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region’s Eco-Environment，Ministry of Education，Chongqing University，Chongqing 400045，China）

An anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection method has been proposed for determination of glucose，sucrose，fructose，stachyose in figwort root.The analytical column was METROSEP CARB 1（150mm×4.0mm）.The elution was performed using 30mmol/L sodium hydroxide isocratic elution and the column temperature was 32℃.A ultrasonoscope was used for extracting sugars.The RSD of area ranged from 0.56%to 9.01%，the linear range was 1～50mg/L，the detection limits was 0.0452～0.0921mg/L，the related coefficient（R）was 0.9931～0.9998，and the spike recoveries ranged from 96.52%to 109.56%.The method was simple and had a high sensitivity.So this method can be applied for the determination of monosaccharides and oligosaccharides in figwort root.

anion exchange chromatography；pulsed amperometric detection；isocratic elution；ultrasonoscope；figwort root；monosaccharides；oligosaccharides

TS207.3

A

1002-0306（2012）07-0340-04

2011－06－15 *通訊聯(lián)系人

熊建飛（1984-），男，碩士研究生，研究方向：離子色譜。

國家科技部重大專項項目（2008ZX07315）。