李永才，陳松江，畢 陽，尹 燕，趙轉(zhuǎn)霞

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

采后一氧化氮處理對油桃抗軟腐病的誘導(dǎo)

李永才，陳松江，畢 陽，尹 燕，趙轉(zhuǎn)霞

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

以油桃為實(shí)驗(yàn)對象，研究了采后NO供體硝普鈉(SNP)處理對低溫貯藏期間油桃根霉軟腐病的控制效果及其機(jī)理。研究結(jié)果表明硝普鈉處理能顯著地抑制損傷接種Rhizopus stolonifer的油桃果實(shí)軟腐病的擴(kuò)展，其中較低濃度5mmol/L的硝普鈉處理效果最好，其病斑直徑僅為對照的75.83%。進(jìn)一步研究表明SNP浸泡處理能顯著地提高低溫貯藏期間油桃果實(shí)組織苯丙氨酸解氨酶(PAL)和過氧化物酶(POD)的活性，且在貯藏后期對組織過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)酶活性具有抑制作用，然而對多酚氧化酶(PPO)的活性沒有明顯的誘導(dǎo)作用?？梢娨谎趸峭ㄟ^改變油桃抗性相關(guān)酶的活性來增強(qiáng)果實(shí)的抗病性。

硝普鈉，油桃，抗性相關(guān)酶，軟腐病，Rhizopus stolonifer

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試油桃 蘭州市園藝實(shí)驗(yàn)場，無病蟲害，無機(jī)械傷的七八成熟油桃，紙箱包裝后運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室冷藏待用;供試匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer) 參照方中達(dá)［11］方法分離于自然發(fā)病的油桃果實(shí)，純化鑒定后PDA上保存待用;NO供體硝普鈉(SNP) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

HH－4型恒溫水浴鍋 金壇市榮華儀器制造有限公司;超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司;高壓滅菌鍋 北京廣順科技發(fā)展有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;UV－2450型紫外－可見分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SNP處理對損傷接種油桃病斑直徑的影響 參照劉志等［12］方法并改進(jìn)，選擇外觀整齊、無病蟲害的油桃洗凈、晾干，75%酒精表面消毒后，用滅菌打孔器在果實(shí)表面等距離打深3mm，直徑2mm的孔4個(gè)，然后將濃度為1、5和10mol/L的SNP 20μL注入孔內(nèi)，以無菌水為對照。24h后接入1×106個(gè)/mL的R.stolonifer孢子懸浮液20μL，晾干后用聚乙烯袋包裹，然后在低溫下(4℃)貯藏并觀察發(fā)病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑并記錄結(jié)果。每次處理果實(shí)用10個(gè)，重復(fù)三次。

1.2.2 酶液提取及酶活性測定

1.2.2.1 粗酶液的制備 取經(jīng)SNP處理后0、4、8、12、16、20d的油桃果實(shí)，取果皮面下1mm處果肉組織樣品3g，用錫箔紙分包后液氮冷凍，并保存在－85℃超低溫冰箱中備用，每次處理果實(shí)用10個(gè)。參照曹建康等［13］方法取待測果肉組織3g于預(yù)冷的研缽中，加入4mL提取緩沖液，在冰浴條件下充分研磨成勻漿，在4℃，12000×g條件下離心15min，上清液為粗酶液。

1.2.2.2 酶活的測定 PAL活性測定參照曹建康等［13］方法，以每分鐘反應(yīng)體系在波長290nm處吸光度增加1所需的酶量為一個(gè)酶活單位，表示為U/mg鮮重;POD活性測定參照Lurie等［14］方法，以每分鐘每毫克果肉組織吸光度增加1時(shí)為一個(gè)過氧化物酶活性單位，表示為△OD470/(min·mg)鮮重;PPO活性測定參照曹建康等［13］方法，制作OD420值隨時(shí)間變化曲線，根據(jù)曲線的初始線性部分計(jì)算每分鐘吸光度變化值△OD420，以每分鐘每毫克果肉組織(鮮重)吸光度增加0.01時(shí)為一個(gè)酶活性單位，表示為是△OD420/(min·mg)鮮重;CAT活性測定參照Clairbone等［15］方法，以每分鐘每毫克果肉組織(鮮重)吸光度減少0.01時(shí)為一個(gè)過氧化氫酶活性單位，表示為△OD240/(min·mg)鮮重;SOD活性測定參照 Prochazkova等［16］方法，以每分鐘每克果肉組織的反應(yīng)體系對氮藍(lán)四挫光化還原的抑制為50%為一個(gè)SOD活性單位(U)，表示為U/mg鮮重。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行分析，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SE)。采用 SPSSStatistics 16.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP處理對油桃抗軟腐病病的誘導(dǎo)效果

由圖1可見，SNP處理后24h接種R.stolonifer的油桃果實(shí)病斑直徑均顯著低于對照(p＜0.05)，其控制效果并未隨著濃度增加而增強(qiáng)。其中5mmol/L SNP的控制效果最好，其病斑直徑僅為對照的75.83%。

圖1 SNP處理對油桃根霉病病斑直徑的影響Fig.1 Effect of SNP treatment on leison diameter of Rhizopus rot in nectarine fruit

2.2 SNP處理對貯藏期間油桃組織PAL活性的影響

SNP處理的果實(shí)在整個(gè)貯藏期內(nèi)組織PAL活性均高于對照，其變化趨勢與對照一致，貯藏前期PAL活性呈上升趨勢，在第12d達(dá)到最大值，然后迅速下降。而SNP處理的果實(shí)PAL活性16d后處于平衡狀態(tài)(圖2)。NO處理后12d和16d油桃組織PAL活性分別比同期對照高33.8%和59.94%。

圖2 SNP處理對油桃組織PAL活性的影響Fig.2 Effect of SNP treatment on PAL activity of nectarine fruit tissue

2.3 SNP處理對油桃組織POD活性的影響

SNP處理對貯藏期間油桃果實(shí)POD活性具有一定的影響(圖3)，在0～4d處理果實(shí)POD呈上升趨勢，而后開始下降，貯藏8d后，處理果POD活性變化平穩(wěn)。而對照果實(shí)POD活性在整個(gè)貯藏期內(nèi)均高于對照，且其變化趨勢不明顯?？梢奡NP處理能有效的穩(wěn)定果實(shí)組織的POD活性，其中在第16d其活性顯著高于對照48.91%。

圖3 SNP處理對油桃組織POD活性的影響Fig.3 Effect of SNP treatment on POD activity of nectarine fruit tissue

2.4 SNP處理對油桃組織PPO活性的影響

SNP處理對貯藏期間油桃果實(shí)PPO活性影響沒有明顯的規(guī)律(圖4)。在貯藏初期(0～4d)處理和對照果實(shí)PPO活性均升高，第4d升至最大值，對照果實(shí)的峰值比處理果實(shí)高30.7%。隨后即開始下降，與對照相比，處理果實(shí)PPO活性的下降速度較為緩慢。除第16d外，在整個(gè)貯藏期內(nèi)處理果實(shí)的PPO酶活性始終低于對照，說明SNP處理對油桃組織PPO酶活性不具有誘導(dǎo)作用。

圖4 SNP處理對油桃組織PPO活性的影響Fig.4 Effect of SNP treatment on PPO activity of nectarine fruit tissue

2.5 SNP處理對油桃組織CAT活性的影響

未處理的油桃果實(shí)組織CAT活性在整個(gè)貯藏期呈上升趨勢(圖5)。而NO處理果在貯藏前期也逐漸增加，第12d達(dá)到最大值，隨后后開始下降?？梢奡NP處理在貯藏后期對油桃組織CAT活性具有明顯的抑制作用，在第20d，NO處理果CAT活性僅為對照果的67%。

圖5 SNP處理對油桃組織CAT活性的影響Fig.5 Effect of SNP treatment on CAT activity of nectarine fruit tissue

2.6 SNP處理對油桃組織SOD活性的影響

由圖6可知，在貯藏前期(0～12d)，對照和處理果實(shí)的SOD活性保持平穩(wěn)，且兩者之間也沒有明顯的差異。貯藏后期果實(shí)SOD活性總體呈下降趨勢，但SNP處理果實(shí)SOD活性下降更為明顯，第20d處理果實(shí)的SOD活性僅為對照的69%?？梢奡NP處理在貯藏后期可明顯地抑制油桃組織SOD活性。

3 討論

NO作為一種廣泛存在于植物體內(nèi)的信號分子，在植物的抗病反應(yīng)中起到重要的作用［17］。本研究表明不同濃度的NO供體SNP處理能顯著地抑制損傷接種Rhizopus stolonifer的油桃果實(shí)軟腐病的擴(kuò)展，這與McDoell等［18］和劉零怡等［10］的研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為NO在番茄等植物抵抗病原菌侵染方面起到了重要的作用。從SNP處理濃度比較我們可以看出，較低濃度處理(5mmol/L)能顯著地抑制病斑的擴(kuò)展，而高濃度SNP處理(10mmol/L)雖然也能起到一定的抑制作用，但效果不及1mmol/和5mmol/L SNP處理，這可能與NO在體內(nèi)主要作為信號分子有關(guān)。

圖6 SNP處理對油桃組織SOD活性的影響Fig.6 Effect of SNP treatment on SOD activity of nectarine fruit tissue

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是許多植物次生物質(zhì)生成合成途徑－苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，與植物的抗逆境脅迫和抗病性密切相關(guān)，在植物的正常生長發(fā)育和抵御病原菌侵害過程中起著重要作用［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NO處理提高了油桃苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性，加速了油桃組織內(nèi)苯丙氨酸的裂解。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)是植物體主要的抗氧化酶系統(tǒng)，能有效地清除機(jī)體內(nèi)的過多的活性氧，以保證機(jī)體正常的生理代謝。有研究表明，NO通過對CAT、SOD活性的影響來調(diào)節(jié)內(nèi)源H2O2和·的含量［20－21］。本研究中的NO浸泡處理對貯藏后期油桃對組織CAT和SOD酶活性具有抑制作用。多酚氧化酶(PPO)是一種以銅為輔基的酶，能催化多種簡單酚類物質(zhì)氧化形成醌類化合物，醌類化合物進(jìn)一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老過程或在采后的貯藏加工過程中，果蔬出現(xiàn)的組織褐變與組織中的多酚氧化酶活性密切相關(guān)［22］。NO處理后的油桃多酚氧化酶(PPO)活性除第16d外均低于對照，有效地延緩油桃組織的褐變。綜上所述NO處理能通過調(diào)節(jié)抗病相關(guān)酶及活性氧代謝體系酶的活性而增強(qiáng)油桃果實(shí)的抗病性。但有關(guān)NO作為信號分子在誘導(dǎo)抗病性中的具體作用機(jī)理及其與其它信號分子如水楊酸、H2O2等之間的協(xié)作關(guān)系等均需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

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Induced resistance to Rhizopus rot(Rhizopus stolonifer) in nectarine fruit by postharvest treatment with nitric oxide

LI Yong－cai，CHEN Song－jiang，BI Yang，YIN Yan，ZHAO Zhuan－xia
(College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

Control effect of sodium nitroprusside(SNP)treatment on Rhizopus rot of nectarine fruit during storage at low temperature and its mechanism were studied.The result showed that postharvest SNP treatment significantly inhibited the development of Rhizopus rot in nectarine fruit inoculated with Rhizopus stolonifer，relative lower concentration of SNP at 5 mmol/L had the best control effect，and its lesion diameter was only 75.83%of the control.Meanwhile activity of phenylalanine ammonia lyase(PAL)，peroxidase(POD)in nectarine tissue were significantly increased during whole storage，catalase(CAT)and superoxide dismutase(SOD)were inhibited by SNP treatment during later storage，but SNP did not stimulate polyphenoloxidase(PPO)activity.These findings suggested that NO might enhance disease resistance of nectarine through changing resistant－related enzyme activities.

sodium nitroprusside;nectarine;resistant－related enzyme;Rhizopus rot;Rhizopus stolonifer

TS255.3

A

1002－0306(2012)10－0340－04

油桃因其果皮光滑無毛、色澤艷麗、風(fēng)味濃甜且營養(yǎng)豐富，深受人民的喜愛。但油桃采收期集中，并正逢高溫季節(jié)，致使油桃采后損失嚴(yán)重，貯藏期短。尤其由青綠霉病、黑斑病、軟腐病等采后病害引起的腐爛嚴(yán)重影響油桃的貨架期［1］。目前果蔬采后病害控制仍以使用化學(xué)殺菌劑為主，但化學(xué)殺菌劑長期使用會對環(huán)境和人類造成危害，同時(shí)病原物也會產(chǎn)生抗藥性，因此尋求安全的采后病害控制新方法已勢在必行。生物防治及低毒化學(xué)藥物處理已在油桃采后病害控制中進(jìn)行了研究［2－5］。一氧化氮(NO)作為一種存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的信號分子，能夠調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育，并參與植物體對各種生物和微生物脅迫反應(yīng)的信息傳遞，尤其在植物抗病反應(yīng)中起重要作用［6］。NO能有效地調(diào)控果蔬的成熟和衰老，包括抑制果蔬組織內(nèi)乙烯的合成、減緩果蔬的呼吸速率、改善果蔬的色澤、硬度等品質(zhì)特征［7］。同時(shí)許多研究表明，外源NO處理能夠誘導(dǎo)番茄和馬鈴薯等果蔬系統(tǒng)產(chǎn)生抗病性［8－10］。但關(guān)于外源 NO誘導(dǎo)抗病性的機(jī)理及在油桃果實(shí)上的應(yīng)用目前尚未見報(bào)道。因此本文以油桃為實(shí)驗(yàn)對象，研究NO供體硝普鈉(SNP)處理對低溫貯藏期間油桃軟腐病的控制效果及其機(jī)理，以期為油桃采后病害的安全控制方法研究提供理論依據(jù)。

2011－07－25

李永才(1973－)，男，博士，副教授，研究方向:果蔬采后貯藏保鮮與病害控制。

國家自然科學(xué)基金(30960243)。