段園園，馬耀，陳貴林

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

中藥科技

鎖陽中粗多酚和粗多糖抗氧化活性的比較△

段園園，馬耀，陳貴林*

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

目的比較鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性，為鎖陽入藥提供依據(jù)。方法100 g鎖陽粉末提取粗多酚和粗多糖。采用超聲波輔助乙醇法提取粗多酚，依次用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇進行萃取。同時用水提醇沉法提取粗多糖。用DPPH·法和ABTS+法進行鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性檢測。結(jié)果多酚粗提物中的總酚含量達到了922.9 mgGAE·g-1(沒食子酸當(dāng)量)，而多糖粗提物中的多糖含量為366.6 mg·g-1(葡萄糖當(dāng)量)。DPPH·法檢測鎖陽粗多酚和粗多糖的IC50值分別為79.3 μg·mL-1和145.6 μg·mL-1。經(jīng)ABTS+法檢測，二者的TEAC值分別為2.12 mmol·g-1和0.69 mmol·g-1。結(jié)論鎖陽粗多酚的抗氧化活性遠高于鎖陽粗多糖。

鎖陽；多酚；多糖；DPPH·；ABTS+

自由基是一類具有不配對電子的活潑化學(xué)基團，人體內(nèi)會不斷產(chǎn)生自由基如超氧陰離子、過氧化氫、羥基離子等。但隨著年齡的增長，人體清除這些自由基的能力在下降。目前認為,人類疾病如各種炎癥、動脈粥樣硬化、早老性癡呆、帕金森氏病、急性腦血管病、癌癥、衰老等,均與自由基的氧化刺激密切相關(guān)[1]，而傳統(tǒng)的合成抗氧化劑又會有很多不良反應(yīng)。因此,開發(fā)天然無害的抗氧化劑迫在眉睫。

鎖陽CynomoriumsongaricumRupr.是一種重要的荒漠寄生植物，藥食兼用，為內(nèi)蒙古道地藥材。鎖陽性甘、溫，具有補腎陽，益精血，潤腸通便的功能[2]。鎖陽富含多酚類及多糖類物質(zhì)，二者兼有清除體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)氧化、抗衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、防輻射等生物活性，所以鎖陽又稱為“不老藥”[2-3]。

目前，對鎖陽的有關(guān)報道中，以多糖類物質(zhì)為主,如多糖提取工藝的研究[4]，多糖對染色體端粒長度的影響[5]等，而抗氧化活性檢測方面較少。對于富含的多酚類物質(zhì)，只有鞣質(zhì)[6]在含量方面有所報道，其他鎖陽多酚類物質(zhì)報道的很少。本實驗采用DPPH·法和ABTS+法對鎖陽多酚和多糖進行抗氧化測定并比較，以求找出鎖陽中的主要抗氧化成分，為把鎖陽開發(fā)為新型天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

選用的鎖陽采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗獨貴特拉鎮(zhèn)，經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系陳貴林教授鑒定，肉質(zhì)莖自然干燥、粉碎，過30目篩，干燥后備用。

1.2 儀器

KUDOS SK7210LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司),UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津有限公司),AP-01真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司),BT2202S sartorious電子天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司),Xllegra X-15R離心機(美國貝克曼庫爾有限公司),RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)。

1.3 試劑

沒食子酸、碳酸鈉、無水乙醇，葡萄糖、苯酚，濃硫酸,國產(chǎn)分析純試劑；福林酚試劑、DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS+[2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]、及Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸)和維生素E購自Sigma公司；抗壞血酸(天津光復(fù)精細化工研究所)。

2 方法

2.1 標準曲線的制作

2.1.1 多酚標準曲線的制作 采用福林酚法[7]，分別取不同濃度的標樣沒食子酸溶液(0～15 μg·mL-1)2 mL，加入福林試劑1.0 mL，充分振蕩后靜置3～4 min，分別加入10 %碳酸鈉溶液1.0 mL，搖勻置于25 ℃恒溫水浴中反應(yīng)2 h，于765 nm下測定吸光度，沒食子酸標準曲線以吸光值A(chǔ)和沒食子酸含量M作回歸方程，見圖1。

圖1 多酚標準曲線

2.1.2 多糖標準曲線的制作 采用苯酚硫酸法[8]，分別取不同濃度的標樣葡萄糖溶液(0～15 μg·mL-1)2 mL，再各加入5 %苯酚試劑1.0 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0 mL搖勻，蓋上試管塞靜置25 min后以蒸餾水為空白對照，于490 nm下測定吸光度，葡萄糖標準曲線以吸光值A(chǔ)和葡萄糖含量C作回歸方程，見圖2。

圖2 多糖標準曲線

2.2 粗多酚及粗多糖的提取

2.2.1 粗多酚的提取 采用超聲波輔助乙醇法，取鎖陽粉末100 g以1∶15的料液比與60 %乙醇溶液混合，室溫下，在功率為350 W超聲波的輔助下進行提取，提取時間8 min，抽濾。乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇相旋蒸。剩余水相依次用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次，每次3 h，將醋酸乙酯相和正丁醇相真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。然后用甲醇將兩相旋蒸的剩余部分合并，置于通風(fēng)廚中直至樣品干燥，然后將所得固體研磨成粉末得到4.09 g，放于干燥陰涼處備用。

2.2.2 粗多糖的提取 采用水提醇沉法，取鎖陽粉末100 g，加入95 %的乙醇按1∶12的料液比進行浸提，浸提12 h后，除去上清液，濾渣自然干燥。將干燥后的濾渣用蒸餾水以1∶12的料液比在97 ℃下回流提取3 h，分別收集上清液和濾渣備用。將收集到的濾渣按上述方法再次回流提取，合并兩次提取液。將提取液減壓濃縮至總體積約120 mL，然后加入95 %乙醇至乙醇濃度達80 %后進行醇沉，12 h后收集沉淀，沉淀即為粗提多糖，待沉淀自然干燥后將其研磨成粉末得到8.05 g，放于干燥陰涼處備用。

2.3 粗多酚和粗多糖的含量測定

同標準曲線的制作相同，多酚含量以mg沒食子酸/g粗提多酚表示，為(922.9±25.2)mgGAE·g-1。多糖含量以mg葡萄糖/g粗提多糖表示為(366.6±15.9)mg·g-1。粗多酚含量為粗多糖的2.5倍。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH·法測定粗多酚和粗多糖 參照Golluecke A P B等[9]的方法，取2 mL不同濃度的樣品液(每個濃度重復(fù)3次)進行測定。按照下列公式計算清除率：

清除率%=[A1-(A-B)]/A1×100 %

式中,A為2 mL DPPH·溶液+2 mL樣品液的吸光度；B為2 mL樣品液+2 mL乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH·溶液+2 mL乙醇的吸光度。

將鎖陽粗多酚和粗多糖清除自由基的能力與維生素C、維生素E清除自由基的能力IC50值相比較，即清除一半自由基時所需的樣品濃度，確定其相對抗氧化活性。

2.4.2 ABTS+法檢測鎖陽粗多酚及粗多糖抗氧化活性 參照Roberta Re等[10]的方法測定，取30 μL不同濃度的樣品液(每個濃度重復(fù)3次)進行測定，將鎖陽粗多酚和粗多糖清除自由基的能力與標準物質(zhì)Trolox清除自由基的能力相比較，轉(zhuǎn)化成TEAC值，即達到一定濃度測試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的濃度，確定其相對抗氧化活性。Trolox標準曲線的線性回歸方程為Y=4.553X+0.818，r=0.997。

3 結(jié)果

3.1 DPPH·法測定鎖陽粗多酚及粗多糖抗氧化活性

DPPH·法測定鎖陽粗多酚和粗多糖抗氧化活性是通過DPPH·的清除率來表示的，即IC50值越小，表明抗氧化活性越大。鎖陽粗多酚IC50值為79.3 μg·mL-1，粗多糖IC50值為145.6 μg·mL-1。粗多酚的IC50為粗多糖的54 %，即粗多酚抗氧化活性為粗多糖的1.8倍，見圖3。

圖3 鎖陽粗多酚和粗多糖IC50值的比較(n=3)

3.2 ABTS+法檢測鎖陽粗多酚及粗多糖抗氧化活性

TEAC值表示為達到一定質(zhì)量濃度測試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰猅rolox的濃度，TEAC值越大，表明抗氧化活性越大。對于ABTS+自由基的清除能力，將各樣品清除ABTS+的能力按Trolox標準曲線轉(zhuǎn)化成TEAC值，鎖陽粗多酚TEAC值為2.12 mmol·g-1，粗多糖TEAC值為0.69 mmol·g-1。粗多酚的TEAC值為粗多糖的3.1倍，見圖4。

圖4 鎖陽粗多酚和粗多糖TEAC值的比較(n=3)

4 討論

本實驗中鎖陽粗多酚含量為粗多糖含量的2.5倍。100 g鎖陽粉末中沒食子酸當(dāng)量為葡萄糖當(dāng)量的1.3倍。DPPH·法和ABTS+法測定鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性基本一致，DPPH·法檢測粗多酚抗氧化能力為粗多糖的2倍，ABTS+法檢測粗多酚抗氧化能力為粗多糖的3.1倍，結(jié)果表明鎖陽粗多酚的抗氧化活性遠高于粗多糖。因此，多酚可視為是鎖陽的主要抗氧化成分之一。雖然鎖陽粗多酚和粗多糖的抗氧化活性不如維生素C和維生素E,但鎖陽中除了多酚和多糖外還有其他的抗氧化成分，如花青素類，三萜類等。鎖陽作為整體入藥，其所有的抗氧化成分的抗氧化活性相加后要優(yōu)于單一成份的抗氧化劑維生素C和維生素E。一般認為水果中起抗氧化作用的成分主要是維生素C，但有研究通過對比了15種水果及33種蔬菜的抗氧化活性與維生素C含量的關(guān)系，表明其抗氧化活性與維生素C含量無明顯的相關(guān)關(guān)系[11]。而且鎖陽作為中藥入藥，其功能不止抗氧化一種，其他功能如補腎、助陽、益精、潤腸等維生素C和維生素E卻未必有。最近的研究表明，鎖陽多糖可以通過抑制D-半乳糖衰老小鼠血細胞和腦細胞染色體末端端粒長度的縮短,從而延緩組織細胞的衰老進程[5]。鎖陽粗多酚及粗多糖的抗氧化活性比一些中藥類如黃連(249.856 μg·mL-1)[12]、地榆(260 μg·mL-1)[13]以及苦丁茶(265.3 μg·mL-1)[14]的抗氧化活性要強。因此，鎖陽多酚和多糖作為新型天然抗氧化劑的原料，再加上鎖陽抗衰老、抗癌、抗脂質(zhì)氧化等功能，將為本身是藥食兼用的鎖陽提供更為廣闊的應(yīng)用前景。

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ComparationofAntioxidantActivityofCrudePolyphenolandPolysaccharideinCynomoriumsongaricum

DUAN Yuan-yuan，MA Yao，CHEN Gui-lin

(CollegeofLifeScience,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China)

Objective: Provide scientific basis forC.songaricumbeing a medicine by comparing antioxidant activity of polyphenol and polysaccharide ofCynomoriumsongaricum.MethodsWe extract crude polyphenols and polysaccharides from 100 gCynomoriumpowder and use ultrasonic-assisted method to extract crude polyphenols and then use petroleum ether,chloroform,ethyl acetate and n-butanol to extract pure polyphenols.At the same time,we extract crude polysaccharides with water extraction and alcohol precipitation method.Detect crude polyphenol and polysaccharide’antioxidant activity with DPPH· and ABTS+method.ResultsTotal phenolic content of crude polyphenol reach 922.9 mg·g-1(gallic acid equivalent),However,the total polysaccharide content of crude polysaccharide is 366.6 mg·g-1(glucose equivalent).Crude polyphenol and polysaccharide’ IC50values of DPPH· were 79.3 μg·mL-1and 145.6 μg·mL-1and TEAC values of ABTS+method were 2.12 mmol·g-1and 0.69 mmol·g-1.ConclusionThe result show that the antioxidant activity of crude polyphenol is far higher than crude polysaccharide.

Cynomoriumsongaricum;Polyphenols;Polysaccharides;DPPH;ABTS+

國家科技支撐計劃項目(2011BAI07B07)，內(nèi)蒙古科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎勵資金項目(2010年度)

*陳貴林，E-mail:guilinchen@yahoo.com.cn

2011-09-13)