劉德勝,劉琳琳,劉為忠
(濱州醫(yī)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264003)
落地生根是景天科植物落地生根Bryophyllum pinnatum(L.f.)Oken的全草及根,別名打不死、花蝴蝶等,以全草入藥,全年可采,收錄于《中華本草》;民間多用于創(chuàng)傷出血、癰疽、喉風(fēng)腫痛及中耳炎等。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)其提取物有增強(qiáng)小鼠免疫功能及血液凝固作用[1-2]。
落地生根中含有豐富的黃酮類物質(zhì)[3]。有研究表明,黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化以及抗輻射等廣泛的藥理活性[4-8]。落地生根的藥用價(jià)值很大程度上與其含有的黃酮類成分有關(guān)。
自由基具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性,其過多或清除過慢,都會(huì)加速機(jī)體衰老,并且會(huì)誘發(fā)多種疾病。黃酮類化合物的酚羥基可與自由基反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。利用黃酮類物質(zhì)開發(fā)自由基清除劑是目前國(guó)內(nèi)外十分關(guān)注的問題[9]。至今尚無適宜的生產(chǎn)工藝從落地生根中提取高含有量黃酮類化合物的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法篩選醇提取落地生根中總黃酮的最佳工藝條件及其清除OH·和O-2·能力進(jìn)行評(píng)價(jià),為深入研究落地生根的藥理作用和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。
1.1 儀器及軟件 紫外可見分光光度計(jì) (TU—1901,北京普析通用儀器有限公司);FA1604s電子天平;超聲波清洗器 (KQ—50E型,昆山市超聲儀器有限公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (Biofuge Primo);高速粉碎機(jī) (HY—0413,環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司)。
1.2 藥品與試劑 蘆丁對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供 (批號(hào):100080-200707);落地生根 (采自山東煙臺(tái),經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院劉孟安教授鑒定為景天科植物落地生根 Bryophyllum pinnatum(L.f.)Oken的全草,50℃干燥,粉碎后過60目篩,備用;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (純度>96%,由阿拉丁試劑公司提供);乙醇為分析純;水 (娃哈哈純凈水);FeSO4、H2O2、鄰苯三酚、濃鹽酸、AlCl3、Tris等試劑等均為分析純。
2.1 落地生根藥材總黃酮的提取 精稱落地生根粉末約0.5 g,按照1∶15的比例加入石油醚 (30~60℃),超聲處理30 min,取出后放冷,過濾,棄去石油醚,待藥渣揮干石油醚后,加入適量的一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中,超聲 (功率80 w,頻率50 kHz)輔助下設(shè)定溫度、料液比,一定時(shí)間后過濾,合并濾液至100 mL量瓶中,藥渣用一定體積分?jǐn)?shù)乙醇洗滌,2~3次,濾液合并到量瓶中,用乙醇定容,搖勻,待用。
2.2 總黃酮含有量的測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)樣,采用文獻(xiàn)[10]所述方法測(cè)定落地生根中的總黃酮含有量;提取率(mg/g)按照每克 (g)藥材中含有的總黃酮量 (mg)計(jì)。
2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品 (120℃干燥至恒質(zhì)量)1.4 mg,用乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中,得質(zhì)量濃度為140.0 μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。
2.2.2 顯色劑溶液的制備 精密稱取AlCl31.0 g,用水溶解并定容至100 mL量瓶中,得質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的顯色劑溶液。
2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL,供試品溶液1 mL,分別置于10 mL量瓶中,各加質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的AlCl3溶液0.5 mL,用乙醇定容至10 mL,放置30 min顯色后,以乙醇為空白參比液,在300~700 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定絡(luò)合物的吸光度,絡(luò)合物于425 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,故測(cè)定時(shí)選用此波長(zhǎng)。
2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取蘆丁對(duì)照品溶液 (140.0 μg/mL),用乙醇稀釋至質(zhì)量濃度分別為140.0、112.0、84.0、56.0、28.0、14.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度A為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為A=0.0031C+0.0026(r2=0.9996),表明在14.0~140.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),蘆丁的質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。
2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一質(zhì)量濃度蘆丁對(duì)照品溶液1.0 mL于10 mL的量瓶中,按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度,結(jié)果RSD為0.9%,表明儀器精密度良好。
2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一待測(cè)落地生根總黃酮提取液1.0 mL于10 mL的量瓶中,按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度,分別于 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果RSD為0.8%,表明供試品溶液在2.0 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一待測(cè)落地生根總黃酮提取液1.0 mL各6份,置于10 mL量瓶中,按照2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法、于425 nm處測(cè)定吸光度,結(jié)果RSD為1.2%,表明方法重復(fù)性良好。
2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取落地生根粉末約0.5 g,精密稱定,平行6份,按照2.1項(xiàng)下處理方法處理后再加入一定量的蘆丁對(duì)照品,在2.2.3項(xiàng)下樣品制備方法制備樣品,在425 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算回收率為100.4%,RSD為2.7%。
2.2.9 樣品溶液中總黃酮的測(cè)定 精密量取樣品溶液1 mL于10 mL量瓶中,按2.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行操作,在波長(zhǎng)425 nm處測(cè)定吸光度值,由回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮。
2.3 單因素試驗(yàn) 選擇對(duì)總黃酮含有量有較大影響的乙醇量、料液比、超聲波輔助提取時(shí)間和提取溫度為考察因素進(jìn)行研究,每個(gè)因素的不同水平重復(fù)3次測(cè)定,取平均值。
2.3.1 料液比的篩選 0.5 g落地生根粉末,分別加入70%乙醇,40℃超聲輔助提取20 min,將料液比分別設(shè)定在1∶40、1∶50、1∶60、1∶70進(jìn)行試驗(yàn),按照樣品制備方法制備樣品,測(cè)定吸光度,確定合適的料液比。
2.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的篩選 0.5 g落地生根粉末,40℃超聲輔助提取20 min,料液比為1∶60,分別用50%、60%、70%、80%的乙醇提取,按照樣品制備方法制備樣品,測(cè)定吸光度,確定合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)。
2.3.3 提取時(shí)間的篩選 0.5 g落地生根粉末,40℃超聲輔助提取,料液比為1∶60,用70%的乙醇提取,選擇提取時(shí)間分別為30、60、90、120 min,按照樣品制備方法制備樣品,測(cè)定吸光度,確定合適的提取時(shí)間。
2.3.4 提取溫度的篩選 0.5 g落地生根粉末,料液比為1∶60,用70%的乙醇提取,超聲輔助提取20 min,設(shè)定提取溫度分別為50、60、70、80℃,按照樣品制備方法制備樣品,測(cè)定吸光度,確定合適的提取溫度。
2.4 正交試驗(yàn) 選用料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素、每個(gè)因素3個(gè)水平,以落地生根總黃酮含有量為考察指標(biāo),按照L9(34)正交表 (見表1)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn),優(yōu)化提取工藝。
表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)
2.5 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察正交試驗(yàn)所得最佳工藝的穩(wěn)定性和合理性,按優(yōu)化工藝條件進(jìn)行試驗(yàn),3次重復(fù),求平均值。
2.6 落地生根總黃酮抗氧化試驗(yàn)
2.6.1 對(duì)OH·的清除能力 采用文獻(xiàn)[11]所述水楊酸捕獲法測(cè)定試樣液的清除OH·能力。
2.6.2 對(duì)超氧自由基的清除能力 采用文獻(xiàn)[12]所述鄰苯三酚自氧化法測(cè)定落地生根總黃酮清除超氧負(fù)離子的能力。
2.6.3 對(duì)有機(jī)自由基 (DPPH)的清除作用 按照文獻(xiàn)[13]所述方法測(cè)定落地生根總黃酮清除有機(jī)自由基的能力。
3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果
3.1.1 料液比對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖1可知,隨著料液比的增大,提取效率逐漸增大,但料液比為1∶60和1∶70時(shí)相差不大,從節(jié)省提取試劑方面考慮,優(yōu)先考慮料液比為1∶60。
圖1 料液比對(duì)提取效果的影響
3.1.2 含乙醇量對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖2可知,含乙醇量為70%時(shí),提取效率最高。
圖2 含乙醇量對(duì)提取效果的影響
3.1.3 提取溫度對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖3可知,提取溫度為70℃時(shí),提取效率最高。
圖3 提取溫度對(duì)提取效果的影響
3.1.4 提取時(shí)間對(duì)落地生根總黃酮提取率的影響 由圖4可知,提取時(shí)間為120 min時(shí),提取效率最高。
圖4 提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響
3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇對(duì)總黃酮提取率影響較大的料液比、含乙醇量、提取時(shí)間和提取溫度,并設(shè)計(jì)各因素水平,按照表1設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn),以總黃酮提取率為考察指標(biāo),結(jié)果見表2;方差分析見表3。
表2 優(yōu)化提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析
表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果
由表2可知,4種因素對(duì)落地生根總黃酮提取的影響從大到小依次為A>B>D>C,表明料液比對(duì)黃酮含有量的影響是最大的,極差分析結(jié)果表明,落地生根總黃酮的提取最佳工藝為A3B2C1D3,即料液比為1∶70、含乙醇量為70%、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為120 min時(shí)提取效果較好。
由表2極差分析結(jié)果表明,4種因素對(duì)落地生根總黃酮提取的影響從大到小依次為A>D>B>C,即料液比對(duì)黃酮含有量的影響最大,提取時(shí)間、甲醇濃度次之,提取溫度影響最小。由表3方差分析結(jié)果可知,料液比 (A)、含乙醇量 (B)、提取時(shí)間 (D)對(duì)落地生根中總黃酮含有量提取率的影響顯著,而提取溫度 (C)的影響不顯著。因此,落地生根總黃酮的提取最佳工藝為A3B2C1D3,即料液比為1∶70、含乙醇量為70%、提取溫度為60℃、提取時(shí)間為120 min時(shí)提取效果較好。
3.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果 準(zhǔn)確稱取3份干燥的落地生根粉約0.5 g,按最佳工藝條件平行操作,測(cè)吸光度,根據(jù)回歸方程得出落地生根中總黃酮量,結(jié)果見表4。
表4 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果(n=3)
3.4 抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果
3.4.1 落地生根總黃酮對(duì)羥自由基的清除率 由圖5可知,落地生根中黃酮對(duì)羥自由基清除率隨濃度的增大而增高,當(dāng)質(zhì)量濃度為100.5 μg/mL時(shí),清除率能達(dá)到96.8%。
圖5 落地生根總黃酮對(duì)羥自由基的清除率
3.4.2 落地生根總黃酮對(duì)陰負(fù)離子的清除率 由圖6可知,落地生根中黃酮對(duì)陰負(fù)離子清除率隨濃度的增大而增大,當(dāng)質(zhì)量濃度為100.5 μg/mL時(shí),清除率能達(dá)到26.0%。
圖6 落地生根中黃酮對(duì)陰負(fù)離子的清除率
本實(shí)驗(yàn)所建立并超聲波輔助提取落地生根總黃酮的方法是可行的。有文獻(xiàn)[14]認(rèn)為落地生根中總黃酮含有量測(cè)定應(yīng)該使用三波長(zhǎng)-分光光度法測(cè)定;但在前期研究中應(yīng)用HPLC定量測(cè)定落地生根中黃酮類成分含有量時(shí)發(fā)現(xiàn),僅槲皮素和山柰酚兩種黃酮含有量已經(jīng)超過了文獻(xiàn)所述總黃酮含有量,所以本研究采用了先除色素及蛋白后再利用文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行總黃酮的定量測(cè)定。
驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,平均產(chǎn)率達(dá)到了9.35 mg/g,其中2個(gè)樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定超過9.27 mg/g,說明本研究所建立的最佳實(shí)驗(yàn)方案是可行的。
在抗氧化性活性試驗(yàn)結(jié)果表明,落地生根總黃酮具有一定的抗氧化能力,且黃酮類化合物的添加量在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)與其抗氧化性呈正相關(guān)。黃酮質(zhì)量濃度在100.5 μg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基、超氧自由基的清除作用分別為96.8%、26.0%相差較大,說明落地生根總黃酮對(duì)不同類型的自由基清除能力不一致。
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