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        RP-HPLC法測(cè)定蒼耳子中蒼術(shù)苷

        2012-11-01 14:08:00劉玉紅王明奎易進(jìn)海
        中成藥 2012年11期
        關(guān)鍵詞:蒼耳子液相色譜儀乙腈

        劉玉紅,朵 睿,2,黃 蛟,王明奎,易進(jìn)海*

        (1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院,四川 成都 610041;2.瀘州醫(yī)學(xué)院,四川 瀘州,646000;3.中國(guó)科學(xué)院成都生物所,四川 成都 610041)

        蒼耳子是菊科植物蒼耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟帶總苞的果實(shí),具有散風(fēng)寒、通鼻竅、祛風(fēng)濕之功效,用于風(fēng)寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵等癥,是鼻淵之要藥[1],為臨床常用有毒中藥。《本草品匯精要》記載蒼耳子“有毒”?!赌戏街饕卸局参铩酚涊d: “蒼耳,有毒部位,全株;以果實(shí)為最毒”。因蒼耳服用過量或炮制不當(dāng)引起的中毒甚至死亡的病例時(shí)有發(fā)生[2-3],病理特征表現(xiàn)為動(dòng)物和人在誤食一定量后出現(xiàn)血糖下降,昏迷,嚴(yán)重者出現(xiàn)腎衰竭甚至死亡;慢性中毒多因初服時(shí)未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)而長(zhǎng)期服用,結(jié)果導(dǎo)致蓄積中毒,引起心肌及肝功能損害[4]?,F(xiàn)代化學(xué)和毒理研究表明蒼耳子的毒性成分主要為水溶性苷類成分:蒼術(shù)苷(atractyloside)與羧基蒼術(shù)苷(carboxyatractyloside)以及其它苷類衍生物等[5]。蒼術(shù)苷及羧基蒼術(shù)苷可抑制體內(nèi)ADP/ATP對(duì)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn),并帶來嚴(yán)重的血糖下降,從而導(dǎo)致體內(nèi)代謝紊亂[6-8],與蒼耳子中毒的表現(xiàn)一致,因此被認(rèn)為是蒼耳子的主要毒性成分。建立蒼耳子中蒼術(shù)苷的測(cè)定方法,對(duì)蒼耳子的毒性成分進(jìn)行監(jiān)控,保證臨床用藥安全是十分必要的。蒼耳子中蒼術(shù)苷的測(cè)定尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,其它樣品中蒼術(shù)苷的測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道有酶聯(lián)免疫法[9]、TLC斑點(diǎn)測(cè)試[10]、GC-MS[11]、HPLC-ELSD[12]、LC-API-MS[13]等,這些方法在定量的準(zhǔn)確性或方法的普適性方面存在一定的局限。本實(shí)驗(yàn)首次建立了RP-HPLC測(cè)定蒼耳子中蒼術(shù)苷的方法,該方法簡(jiǎn)便、快速,重復(fù)性好,為控制蒼耳子的質(zhì)量和毒性提供了參考。

        1 材料

        Agilent 1200型高效液相色譜儀 (包括四元泵,DAD檢測(cè)器,柱溫箱,自動(dòng)進(jìn)樣器,工作站);KQ—100超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司),Mettler Toledo XS205型電子天平 (瑞士),Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng) (美國(guó))。

        實(shí)驗(yàn)樣品購(gòu)于四川、遼寧、山東、河北、內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地共35批蒼耳子藥材和飲片,由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定。蒼術(shù)苷對(duì)照品自制,純度為98.1%,經(jīng)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)分析,鑒定其結(jié)構(gòu)。乙腈為美國(guó)Fisher色譜純;水為Millipore Milli-Q超純水系統(tǒng)制得的超純水;其余試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱;流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液 (20∶80);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;柱溫35℃。對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖1。同時(shí)對(duì)樣品中蒼術(shù)苷的200~400 nm紫外光譜圖與對(duì)照品的紫外光譜圖進(jìn)行比較,表明樣品峰無其它雜質(zhì)干擾。

        圖1 蒼術(shù)苷對(duì)照品 (A)及蒼耳子供試品 (B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of atractyloside(A)and Xanthii Fructus(B)

        2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蒼術(shù)苷對(duì)照品11.29 mg,置10 mL量瓶中,加10%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻。再精密量取上述對(duì)照品溶液1 mL,置10 mL量瓶中,加10%甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL中含蒼術(shù)苷0.1129 mg的對(duì)照品溶液。

        2.3 供試品溶液的制備 取蒼耳子粉未 (過三號(hào)篩)1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加水20 mL,精密稱定質(zhì)量,超聲 (功率250 W,頻率40 kHz)處理40 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,用水補(bǔ)足減失質(zhì)量,離心 (12000 r/min,5 min),取上清液作為供試品溶液。

        2.4 方法學(xué)考察

        2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取蒼術(shù)苷對(duì)照品各1、3、6、9、12、15、20 μL,注入液相色譜儀中,以進(jìn)樣量 (μg)為橫坐標(biāo),對(duì)照品峰面積 (A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果蒼術(shù)苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=458.9X-3.884(r=0.9999),線性范圍為0.1129 ~2.258 μg。

        2.4.2 定量限和檢出限 將2.2項(xiàng)下的溶液,用10%甲醇溶液稀釋成0.01129 mg/mL的溶液,進(jìn)樣測(cè)定,按10倍和3倍信噪比計(jì)算出蒼術(shù)苷的定量限和檢出限分別約為34 ng、11.3 ng。

        2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(樣品01)10 μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣5次,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,蒼術(shù)苷的峰面積的RSD為0.58%,表明儀器精密度好。

        2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(樣品01)10 μL,注入液相色譜儀,分別于0、1、4、8、24 h檢測(cè),記錄色譜圖,蒼術(shù)苷的峰面積的RSD為0.83%,表明供試品溶液于24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一蒼耳子 (樣品01)粉未,精密稱取約1 g,共5份,按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精密吸取供試品溶液10 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計(jì)算出蒼術(shù)苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.14 mg/g、RSD為1.0%,表明該方法重復(fù)性好。

        2.4.6 加樣回收試驗(yàn) 取已知蒼術(shù)苷含有量的樣品 (樣品01,2.14 mg/g),0.5 g,共6份,精密稱定,準(zhǔn)確加入適量對(duì)照品,照2.3項(xiàng)下操作,測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

        表1 蒼術(shù)苷的加樣回收率實(shí)驗(yàn) (n=6)Tab.1 Recovery of atractyloside

        2.5 樣品測(cè)定 照2.3項(xiàng)下方法制備35批次蒼耳子樣品的供試品溶液,分別精密吸取10~20 μL注入液相色譜儀測(cè)定,在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算各樣品中蒼術(shù)苷,結(jié)果見表2。

        3 討論

        3.1 提取溶劑和樣品制備方法的考察 蒼術(shù)苷為水溶性苷類。本實(shí)驗(yàn)比較了水、25%甲醇、50%甲醇對(duì)蒼術(shù)苷超聲提取的效果,3種溶劑測(cè)定同一樣品的含有量分別為0.214%、0.191%,0.0723%,表明不同溶劑提取對(duì)蒼術(shù)苷有顯著影響,以水提取效果最佳。又以水為提取溶劑,比較了超聲提取30、40、60 min的差異,結(jié)果表明提取 40 min即可。

        表2 蒼耳子樣品中蒼術(shù)苷的測(cè)定結(jié)果 (n=3)Tab.2 Contents of atractyloside in Xanthii Fructus

        3.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

        3.2.1 流動(dòng)相系統(tǒng)的篩選 參照文獻(xiàn)[13],采用甲醇-醋酸鹽緩沖液系統(tǒng),結(jié)果基線噪音太大,該系統(tǒng)不適合紫外檢測(cè)器短波長(zhǎng)檢測(cè)。又自行摸索比較了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水、乙腈-磷酸鹽等系統(tǒng),結(jié)果以乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)較好,但仍存在色譜峰拖尾嚴(yán)重的問題,故對(duì)不同色譜柱的分離效果進(jìn)行比較。

        3.2.2 色譜柱的篩選 比較了Phenomenex LUNA C18(2)(4.6 mm ×250 mm,5 μm),Agilent Eplise XDB-C18柱 (4.6 mm ×250 mm,5 μm),親水性C18柱 Phenomenex Gemini C18110A(4.6 mm×250 mm,5 μm),苯基柱 Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm,5 μm)的分離效果,結(jié)果以苯基柱分離效果最佳,峰形較為對(duì)稱。

        3.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 蒼術(shù)苷為貝殼杉烯苷類化合物,DAD掃描可見僅有末端吸收,故采用203 nm為測(cè)定波長(zhǎng),結(jié)果表明靈敏度較高,待測(cè)成分基線分離,重現(xiàn)性良好,符合定量測(cè)定的要求。

        3.3 測(cè)定結(jié)果 35批次蒼耳子藥材及飲片的測(cè)定結(jié)果,表明不同來源蒼耳子中蒼術(shù)苷的含有量差異很大,有必要制定蒼術(shù)苷的限量標(biāo)準(zhǔn)。有報(bào)道稱南方產(chǎn)蒼耳子低毒,北方產(chǎn)蒼耳子毒性較大,本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果與此結(jié)論有相同趨勢(shì)。

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