周慶凱，孫 巍，曹鳳蘭，杭太俊

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.天津天士力制藥股份有限公司，天津 300402）

1 引言

藥品的清潔驗(yàn)證就是對(duì)現(xiàn)行的清潔程序進(jìn)行規(guī)定，并驗(yàn)證現(xiàn)行的清潔規(guī)程能否一如既往的達(dá)到良好的清潔效果。也就是通過對(duì)擦拭取樣與淋洗取樣的檢測(cè)，來確定殘留量，從而驗(yàn)證清潔方法是否能將殘留物清潔至標(biāo)準(zhǔn)值以下。

總有機(jī)碳 (Total Organic Carbon，以下簡(jiǎn)稱TOC法)檢測(cè)方法用于純化水和注射用水的檢測(cè)早在20世紀(jì)90年代就已被美國(guó)和歐洲藥典先后收錄，我國(guó)在《中國(guó)藥典》2005年版也對(duì)該方法進(jìn)行了收錄。TOC方法是通過對(duì)水中的有機(jī)物進(jìn)行氧化，使有機(jī)物中的碳轉(zhuǎn)化為二氧化碳，并通過檢測(cè)二氧化碳的量，來計(jì)算水中有機(jī)物的量。TOC檢測(cè)方法之所以能夠用來檢測(cè)水質(zhì)，就是因?yàn)門OC法能夠較為精確的確定水中的有機(jī)物是否超出標(biāo)準(zhǔn)。從而達(dá)到檢測(cè)水質(zhì)的目的。根據(jù)相同原理，TOC檢測(cè)方法同樣可以用于清潔驗(yàn)證。

1.1 中藥產(chǎn)品清潔驗(yàn)證所面臨的挑戰(zhàn) 西藥產(chǎn)品由于自身成分單一，毒理學(xué)數(shù)據(jù)全面，清潔驗(yàn)證過程相對(duì)簡(jiǎn)單，且已經(jīng)形成了一套完善的標(biāo)準(zhǔn)建立方法［1］。但對(duì)于中藥產(chǎn)品清潔驗(yàn)證仍然存在挑戰(zhàn)。

首先，中藥產(chǎn)品成分復(fù)雜，一種中藥產(chǎn)品往往存在著成百上千種不同的成分，其中大部分成分為痕量，想要對(duì)殘留的每一種成分都進(jìn)行定量是不現(xiàn)實(shí)的。

其次，中藥缺少毒理學(xué)數(shù)據(jù)。西藥復(fù)方產(chǎn)品清潔驗(yàn)證往往是選擇其中活性最大或者是最難清潔的物質(zhì)作為標(biāo)志物，通過控制標(biāo)志物的量，確定標(biāo)志物的殘留量低于所設(shè)立的標(biāo)準(zhǔn)，來達(dá)到控制殘留，驗(yàn)證清潔效果的目的。但是對(duì)于中藥來說，毒理學(xué)數(shù)據(jù)的缺少導(dǎo)致很難，甚至是無法確定清潔標(biāo)志物，這就造成了我們無法完全借鑒西藥清潔驗(yàn)證的經(jīng)驗(yàn)。而毒理學(xué)數(shù)據(jù)的缺少也會(huì)對(duì)中藥清潔驗(yàn)證限度的建立造成影響。

再次，對(duì)于中藥來說，尤其是對(duì)于準(zhǔn)備走出國(guó)門的中藥產(chǎn)品來說，國(guó)外的清潔驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)較為嚴(yán)格［2］，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的要求也更高。對(duì)于植物藥，中國(guó)傳統(tǒng)中藥，國(guó)外一直保持謹(jǐn)慎的態(tài)度，中藥想要走出國(guó)門，就需要提供足夠的數(shù)據(jù)，這對(duì)中藥產(chǎn)品來說無疑是存在困難的。而就清潔驗(yàn)證來言，需要提供方法的原理，可行性，限度的建立，依據(jù)等等相應(yīng)數(shù)據(jù)。對(duì)于中藥來說，國(guó)外嚴(yán)格的清潔驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，全面的數(shù)據(jù)需求，都對(duì)中藥的清潔驗(yàn)證提出了挑戰(zhàn)。

最后，目前常用的清潔驗(yàn)證方法不能滿足中藥清潔驗(yàn)證的需要［3］。中藥常用的清潔驗(yàn)證檢測(cè)方法為HPLC法，UV法等［4］，UV法僅能對(duì)存在共軛基團(tuán)的化合物產(chǎn)生響應(yīng)，靈敏度低，檢測(cè)存在局限性。HPLC法的靈敏度雖然較UV法高，但其仍然不能滿足清潔驗(yàn)證痕量檢測(cè)的需要，且使用HPLC檢測(cè)時(shí)，由于樣品中存在多種物質(zhì)，可能在HPLC色譜圖中出現(xiàn)未知雜峰，而FDA需要對(duì)未知峰進(jìn)行解釋，可見目前常用的檢測(cè)方法對(duì)于中藥產(chǎn)品清潔驗(yàn)證均存在局限性［5］。

1.2 TOC法的優(yōu)勢(shì) TOC檢測(cè)法為非專屬性方法，檢測(cè)范圍廣，響應(yīng)物質(zhì)多［6］。中藥制劑所含成分大多為蛋白質(zhì)，纖維素，糖類，生物堿類，皂苷類，揮發(fā)油類，有機(jī)酸類，鞣質(zhì)等，傳統(tǒng)的清潔驗(yàn)證方法如HPLC法，UV法，GC法，滴定法等，一般僅能對(duì)其中某一種或者某一類成分進(jìn)行定量檢測(cè)。而TOC檢測(cè)法為非專屬性方法，能對(duì)所有含碳的有機(jī)物產(chǎn)生響應(yīng)值，而非某一種或者某一類物質(zhì)。上述物質(zhì)均為含有有機(jī)碳的有機(jī)物。TOC法通過對(duì)于總有機(jī)碳量進(jìn)行限度設(shè)置，檢測(cè)總有機(jī)碳量，判斷其是否低于標(biāo)準(zhǔn)從而達(dá)到驗(yàn)證清潔效果的目的。將中藥產(chǎn)品中所含全部有機(jī)物視為一個(gè)整體進(jìn)行限量，既可以達(dá)到良好的清潔驗(yàn)證效果，又可以有效地回避清潔標(biāo)志物無法確定，未知峰無法解釋的問題。

TOC法的應(yīng)用并不受限于毒理學(xué)數(shù)據(jù)。因?yàn)門OC法對(duì)有機(jī)物中的碳具有專屬性，無需尋找清潔標(biāo)志物，而限度的制定，也可以根據(jù)多批次樣品檢測(cè)進(jìn)行的數(shù)據(jù)積累而從經(jīng)驗(yàn)角度制定。這樣就解決了中藥產(chǎn)品毒理學(xué)數(shù)據(jù)的不足所引起的問題。

TOC法具有滿足痕量檢測(cè)的靈敏度。它對(duì)于有機(jī)碳的靈敏度可達(dá)1×10－9，比傳統(tǒng)檢測(cè)方法靈敏度高1×102～1×103倍，可以滿足中藥產(chǎn)品對(duì)于痕量檢測(cè)的要求，而且由于是將所有有機(jī)物視為一個(gè)整體進(jìn)行檢測(cè)，可以較好的回避無法對(duì)每一種殘留物質(zhì)均進(jìn)行定量的難題。

由此可見，TOC法理論上可以解決中藥清潔驗(yàn)證所面臨的難題，應(yīng)該是一種比較科學(xué)，高效的清潔驗(yàn)證方法。

2 儀器與試劑

2.1 儀器 GE sievers 900實(shí)驗(yàn)室型總有機(jī)碳分析檢測(cè)儀；Waters AcquityTMUPLC分析儀。

2.2 試劑 蔗糖對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 111507-200001)；1，4-對(duì)苯醌標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Enrenstorfer，批號(hào)Cl0537000)；磷酸 (天津市化學(xué)試劑三廠，批號(hào)20090606)；碳酸鈉 (天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)20050428)。

2.3 供試品 復(fù)方丹參裝囊滴丸 (生產(chǎn)廠家:天士力股份有限公司，批號(hào):DP006002031)。

3 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證 TOC方法也是分析檢測(cè)方法，所以也要通過方法學(xué)的驗(yàn)證后才能應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)［5］。人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)對(duì)于方法學(xué)實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)指導(dǎo)原則簡(jiǎn)稱ICH Q2B［7］為其提出了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。筆者以復(fù)方丹參裝囊滴丸為例，對(duì)TOC檢測(cè)法的線性，精密度，準(zhǔn)確度，檢測(cè)限與定量限，穩(wěn)定性，耐用性，殘留物回收率等進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。經(jīng)過試驗(yàn) (儀器為GE Sievers 900實(shí)驗(yàn)室型總有機(jī)碳分析檢測(cè)儀)，得到如下數(shù)據(jù):

線性［8］:使用蔗糖對(duì)照品 (批號(hào) 111507-200001中國(guó)藥品生物制品檢定所)適量，加入適量超純水，溶解，定容，配置成TOC質(zhì)量濃度約為50000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水分別稀釋適宜倍數(shù)，分別對(duì)溶液編號(hào)為1～6，檢測(cè)超純水空白與1～6號(hào)溶液的TOC值，繪制線性散點(diǎn)圖。

結(jié)果:超純水空白為84.6 μg/L，線性方程為y=1.0071x，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，范圍為200～25000 μg/L。

精密度:對(duì)于復(fù)方丹參裝囊滴丸清潔驗(yàn)證樣品1連續(xù)檢測(cè)6次，計(jì)算RSD，結(jié)果RSD為0.466%

重復(fù)性:制作復(fù)方丹參裝囊滴丸樣品6份，編號(hào)為1～6，依次進(jìn)行總有機(jī)碳檢測(cè)，計(jì)算RSD。結(jié)果RSD為1.540%

準(zhǔn)確度:檢測(cè)6份復(fù)方丹參裝囊滴丸樣品的總有機(jī)碳濃度，加入已知總有機(jī)碳濃度的蔗糖對(duì)照品溶液，計(jì)算回收率與回收率RSD。結(jié)果:平均回收率為100.25%，RSD為2.37%

檢測(cè)限與定量限:對(duì)空白超純水溶液進(jìn)行10次檢測(cè)，計(jì)算10次結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，檢測(cè)限=3.3 σ/k，定量限=10 σ/k，k=線性方程的斜率。結(jié)果:空白超純水樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.83，線性方程斜率為1.0071，檢測(cè)限為2.72 μg/L，定量限為8.24 μg/L。

穩(wěn)定性:取復(fù)方丹參裝囊滴丸樣品，分別于0、2、4、6、8、24 h進(jìn)行TOC檢測(cè)。觀察結(jié)果變化。結(jié)果:24 h內(nèi)檢測(cè)結(jié)果未發(fā)生顯著變化。

耐用性:取已知有機(jī)碳濃度的蔗糖與1，4-對(duì)苯醌對(duì)照品，分別用磷酸及碳酸鈉調(diào)節(jié)樣品為pH4，pH7，pH10，進(jìn)行 TOC檢測(cè)。觀察結(jié)果變化。結(jié)果:pH的改變未對(duì)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

取樣回收率［9］:取生產(chǎn)設(shè)備表面相同材質(zhì)鋼板，面積為10 cm×10 cm，6塊，分別滴加100 μL、200 μL、500 μL、750 μL、1 mL、1.5 mL 的配制好的復(fù)方丹參裝囊滴丸溶液，待其自然晾干后，使用規(guī)定的TOC擦拭專用棉簽按規(guī)定的方法擦拭鋼板表面，將棉簽折斷于裝有40 mL超純水的低TOC取樣瓶中，將樣品分別編號(hào)為1～6。按編號(hào)順序上樣檢測(cè)總有機(jī)碳質(zhì)量濃度。分別取等量復(fù)方丹參裝囊滴丸溶液置于裝有空白擦拭棉簽與40 mL超純水的低TOC取樣瓶中，上樣檢測(cè)總有機(jī)碳質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率。結(jié)果:擦拭回收率65.8% ～73.5%RSD為5.2%

驗(yàn)證結(jié)論:TOC檢測(cè)方法各項(xiàng)驗(yàn)證結(jié)果均符合方法學(xué)驗(yàn)證規(guī)定［10］，其殘留物回收率項(xiàng)證明了該取樣方法對(duì)復(fù)方丹參裝囊滴丸具有較好的回收率，證實(shí)了該方法可以作為復(fù)方丹參裝囊滴丸的清潔驗(yàn)證方法。

3.2 TOC方法與UPLC方法應(yīng)用于清潔驗(yàn)證實(shí)例的對(duì)比 目前，天津天士力股份公司復(fù)方丹參裝囊滴丸的含量測(cè)定方法采用超高效液相色譜法 (UPLC)方法，該方法可對(duì)復(fù)方丹參裝囊滴丸中8個(gè)主要成分進(jìn)行定量檢測(cè)。其檢測(cè)限根據(jù)各成分的不同最低可達(dá)50 μg/L，該方法應(yīng)用于定量測(cè)定可以達(dá)到很好的檢測(cè)效果，但應(yīng)用于清潔驗(yàn)證卻仍存在著局限性，首先，清潔驗(yàn)證屬于痕量檢測(cè)，UPLC方法的靈敏度仍不足以達(dá)到要求，其次，清潔驗(yàn)證不僅需要檢測(cè)藥品的殘留，還要同時(shí)關(guān)注輔料，清潔劑等其他應(yīng)用于生產(chǎn)，清潔等過程的原料的殘留。而UPLC方法因?yàn)閷?duì)檢測(cè)物響應(yīng)的限制，無法滿足以上要求。

TOC法，對(duì)有機(jī)碳的檢測(cè)限可達(dá)2 μg/L，而復(fù)方丹參裝囊滴丸產(chǎn)品中，無論是產(chǎn)品本身，還是輔料，清洗劑均屬于有機(jī)物，使用TOC方法可以同時(shí)對(duì)所有有機(jī)碳的殘留量進(jìn)行檢測(cè)。通過限制殘留的有機(jī)碳的量，達(dá)到驗(yàn)證清潔效果，控制藥品質(zhì)量的作用。

以上，僅從理論上證實(shí)TOC法較UPLC法更適合作為復(fù)方丹參裝囊滴丸的清潔驗(yàn)證方法。

通過對(duì)20個(gè)復(fù)方丹參裝囊滴丸生產(chǎn)線清潔驗(yàn)證樣品分別使用TOC法與UPLC法進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果，見表1。

表1 20個(gè)取樣點(diǎn)TOC方法與UPLC方法檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of cleaning validation of twenty sampling points with TOC and UPLC methods

由表1可見TOC方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出清潔驗(yàn)證樣品中的有機(jī)碳?xì)堄嗔浚瑥亩鎸?shí)地反映出清潔效果。而UPLC方法由于靈敏度和檢測(cè)范圍的關(guān)系，無法真實(shí)地反映殘余情況，由此可見，對(duì)于復(fù)方丹參裝囊滴丸的清潔驗(yàn)證來說，TOC方法確實(shí)更科學(xué)，更準(zhǔn)確。

4 討論

通過以復(fù)方丹參裝囊滴丸為例證實(shí)，TOC法確實(shí)可以應(yīng)用于中藥產(chǎn)品的清潔驗(yàn)證中，但筆者發(fā)現(xiàn)，TOC檢測(cè)方法也有以下缺點(diǎn)。

TOC法對(duì)有機(jī)碳具有專屬性，如果殘留物中有可能存在無機(jī)活性成分，則TOC法無法對(duì)其產(chǎn)生響應(yīng)值，這時(shí)候仍需要使用傳統(tǒng)專屬性方法，例如UPLC法，GC法等對(duì)該無機(jī)活性成分進(jìn)行定量檢測(cè)；TOC法對(duì)于乙醇較為敏感。中藥生產(chǎn)中有些步驟必須使用乙醇，或者使用乙醇進(jìn)行清潔，甚至整個(gè)過程都需要在乙醇中進(jìn)行，使用TOC法有可能出現(xiàn)問題［11］；對(duì)于一些不溶或難溶于水的中藥，也不建議使用TOC法，TOC法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出溶解于水中的有機(jī)物的總有機(jī)碳量，但對(duì)于不溶于水中的物質(zhì)，則很難反映出真實(shí)的殘留情況。比如一些中藥中含有的難溶于水的油性化合物。雖然也可通過擦拭取樣回收，但檢測(cè)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果RSD相差較大的情況［12］。綜上所述，TOC法對(duì)于水溶性中藥產(chǎn)品，是一種科學(xué)有效的清潔驗(yàn)證方法。

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