尹麗波，趙啟苗，林桂梅，侯 影，賈天柱

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制重點(diǎn)研究室／遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 杏林學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110167）

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，味苦、辛、酸，性微寒，歸脾胃經(jīng)，具有破氣消積、化痰散痞的功能，常用于積滯內(nèi)停、痞滿(mǎn)脹痛等癥［1］。枳實(shí)主要有效成分有生物堿，如辛弗林、N-甲基酪胺等；黃酮類(lèi)成分，如橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷等［2］。枳實(shí)歷代有多種炮制方法，但均需先切制成枳實(shí)片，再根據(jù)需要按不同方法炮制。此外，清代吳儀洛在《本草從新》中也曾提出“藥肆中俱切為飲片”，中藥必須切成飲片才能用于臨床［3］。目前，切制枳實(shí)飲片工藝控制主要憑經(jīng)驗(yàn)，缺乏具體的工藝參數(shù)。本試驗(yàn)以辛弗林含量和柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量及出膏率為指標(biāo)對(duì)切制枳實(shí)工藝進(jìn)行優(yōu)選，為規(guī)范切制枳實(shí)的炮制工藝提供技術(shù)參數(shù)，為切制枳實(shí)飲片的質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

FA1004B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；METTLER AE240型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士METTLER）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（超聲電功率250W，頻率40kHz）；DG101-2A烘箱；日本島津LC-20AT液相色譜儀（SPD-M20A檢測(cè)器，LC-20AB泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CBM-20A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換模器）；島津LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站。

枳實(shí)生品購(gòu)自江西新干縣，經(jīng)鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果；辛弗林對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110727-200306）；柚皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110722-200309），橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)11072-200613）；新橙皮苷（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%），娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 辛弗林含量的測(cè)定

2.1.1 測(cè)定條件

色譜柱為Diamonsil C18（5μm，200mm×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇-磷酸水溶液（0.18%磷酸，0.22%十二烷基硫酸鈉）58∶42；流速：1mL·min-1；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm；進(jìn)樣量：10μL。色譜見(jiàn)圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取辛弗林對(duì)照品，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得0.1852mg·mL-1的辛弗林對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取切制枳實(shí)樣品適量，粉碎，取中粉1g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇100mL，稱(chēng)定重量，超聲提取30min后放冷，再稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液50mL至蒸發(fā)皿中，蒸干，稱(chēng)干膏重。干膏加甲醇溶解，移至10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，備用。

圖1 辛弗林對(duì)照品及供試品色譜

2.1.4 方法學(xué)考察

（1）線(xiàn)性范圍考察。精密吸取辛弗林對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按“2.1.1”項(xiàng)下操作，并測(cè)定峰面積積分值，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得辛弗林線(xiàn)性回歸方程為Y＝6E+06X-711551，相關(guān)系數(shù)r＝0.9996。線(xiàn)性范圍為0.1852～3.704μg／mL。

（2）精密度試驗(yàn)。精密吸取供試品溶液10μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果RSD為1.8%，表明儀器精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取供試品溶液10μL，分別于0、1、2、4、8、24h進(jìn)樣分析，按“2.1.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定供試品中辛弗林含量，結(jié)果RSD為1.8%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件操作，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定各樣品中辛弗林的平均含量為0.3312%，RSD為1.7%。

（5）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱(chēng)定6份已知含量枳實(shí)樣品0.5g，分別加入0.8924mg·mL-1的辛弗林對(duì)照品溶液2mL，按照“2.1.3”項(xiàng)下操作，配制成供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣操作，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果辛弗林的加樣回收率為98.75%，RSD為1.6%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 辛弗林加樣回收率

2.2 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量測(cè)定

2.2.1 測(cè)定條件

色譜柱：Diamonsil C18（5μm，200mm×4.6mm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（20.5∶79.5）；流速：0.6mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm。色譜見(jiàn)圖2。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取柚皮苷對(duì)照品1.570mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.03140mg·mL-1的柚皮苷對(duì)照品溶液；精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品2.835mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.0567mg·mL-1的橙皮苷對(duì)照品溶液；精密稱(chēng)取新橙皮苷對(duì)照品2.355mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.0471 mg·mL-1的新橙皮苷對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作制得的溶液，精密吸取2mL于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，用0.45μm的微孔濾膜濾膜濾過(guò)，備用。

圖2 黃酮類(lèi)對(duì)照品及供試品色譜

2.2.4 方法學(xué)考察

（1）線(xiàn)性范圍。精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液1、5、10、20、50、100μL，按“2.1.1”項(xiàng)下操作，測(cè)定峰面積積分值，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得出柚皮苷線(xiàn)性回歸方程為Y＝1E+07X-288165，相關(guān)系數(shù)r＝0.9999。表明柚皮苷的進(jìn)樣量在0.0314～3.14μg／mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測(cè)定峰面積積分值，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得出橙皮苷線(xiàn)性回歸方程為Y＝4E+06X+17543，相關(guān)系數(shù)r＝0.9998。表明橙皮苷的進(jìn)樣量在0.0567～1.134 μg／mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。精密吸取新橙皮苷對(duì)照品溶液1、5、10、20、50、100μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測(cè)定峰面積積分值，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得新橙皮柑線(xiàn)性回歸方程為Y＝8E+06X+129867，相關(guān)系數(shù)r＝0.9999。表明新橙皮苷的進(jìn)樣量在0.0471～4.710μg／mL范圍內(nèi)范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

（2）精密度試驗(yàn)。精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果測(cè)定供試品溶液中柚皮苷峰面積RSD為2.1%，橙皮苷峰面積RSD為1.5%，新橙皮柑峰面積RSD為2.4%，表明精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液10μL，分別于0、1、2、4、8、24h進(jìn)樣分析，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件操作，結(jié)果測(cè)定柚皮苷峰面積RSD為1.4%，橙皮苷峰面積的RSD為1.9%，新橙皮苷的峰面積RSD為1.1%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)。取同批樣品6份，按“2.2.3”項(xiàng)下制作供試品溶液，“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，進(jìn)樣10μL，測(cè)定各樣品中柚皮苷的RSD為2.4%；橙皮苷的RSD為1.8%，RSD為1.7%。

（5）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱(chēng)定6份已知含量的枳實(shí)樣品0.04g，分別加入1.8998mg·mL-1的柚皮苷對(duì)照品溶液2mL，按照“2.2.3”項(xiàng)下操作配制成6份加樣供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，柚皮苷的加樣回收率為99.11%，RSD為1.2%。結(jié)果見(jiàn)表2。

精密稱(chēng)定6份已知含量的枳實(shí)樣品0.35g，分別加入1.5047mg·mL-1的橙皮苷對(duì)照品溶液2mL，按照“2.2.3”項(xiàng)下操作配制成6份加樣供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，橙皮苷的加樣回收率為98.05%，RSD為2.1%，結(jié)果見(jiàn)表3。

精密稱(chēng)定6份已知含量的枳實(shí)樣品0.02g，分別加入1.2672mg·mL-1的新橙皮苷對(duì)照品溶液2mL，按照“2.2.3”項(xiàng)下操作配制成6份加樣供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果新橙皮苷的加樣回收率為99.52%，RSD為1.3%，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 枳實(shí)軟化方法的正交試驗(yàn)

3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選取浸泡法為枳實(shí)的軟化方法。在軟化過(guò)程中，考慮到軟化時(shí)間（A）、軟化溫度（B）、軟化加水量（C）三個(gè)因素為主要影響因素，故將這三個(gè)因素作為正交試驗(yàn)的考察因素，選用L9（3）4正交表安排實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，因素水平安排見(jiàn)表5，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下色譜條件和制備方法分別測(cè)定枳實(shí)中辛弗林含量和黃酮（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）含量以及出膏率，用加權(quán)平均法計(jì)算綜合評(píng)分，其中辛弗林的含量，黃酮總含量以及出膏率的權(quán)重分別為0.4，0.4和0.2。

表2 柚皮苷加樣回收率

表3 橙皮苷加樣回收率

表4 新橙皮苷加樣回收率

表5 因素水平

3.2 試驗(yàn)方法

按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，取枳實(shí)藥材100g，加入一定量水，在不同軟化溫度下軟化。取樣測(cè)定，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算綜合評(píng)分。測(cè)定數(shù)據(jù)和計(jì)算結(jié)果分別見(jiàn)表6、表8，方差分析結(jié)果見(jiàn)表9。

表6 L9（3）4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果分解

表8 枳實(shí)軟化正交試驗(yàn)因素水平分析

表9 方差分析

3.3 試驗(yàn)結(jié)果及分析

表7和表8結(jié)果顯示：因素A對(duì)綜合評(píng)分的結(jié)果有顯著影響，因素B、C對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響。極差分析認(rèn)為各因素的主次順序是A＞B＞C。最佳工藝條件為A3B3C2，即每100g藥材使用100mL水，在溫度為10℃下，軟化12h。

4 枳實(shí)的切制研究

枳實(shí)的切制研究，先將枳實(shí)按以下方法進(jìn)行切制：①橫切，使藥材的厚度為0.5mm；②橫切，使藥材的厚度為1～2mm；③橫切，使藥材的厚度為2～4mm；④縱切，使藥材的厚度為0.5mm；⑤縱切，使藥材的厚度為1～2mm；⑥縱切，使藥材的厚度為2～4mm。分別取上述枳實(shí)切片按“2.1.2”和“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成樣品，分別測(cè)得上述6種樣品中的指標(biāo)，進(jìn)行綜合評(píng)分，分別為85.44，95.21，90.12，88.32，96.89，90.78。其中切制厚度為1～2mm枳實(shí)樣品綜合評(píng)分要明顯高于切制成其他厚度的。切制方法的考察，橫切與縱切對(duì)枳實(shí)樣品的綜合評(píng)分影響不大，且枳實(shí)藥材切制過(guò)程中橫切較縱切容易，故選用橫切作為枳實(shí)的切制方法。

5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證上述最佳工藝的科學(xué)性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，進(jìn)行了3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 驗(yàn)證試驗(yàn)

6 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在正交試驗(yàn)之前做過(guò)軟化方法篩選的預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別選取浸泡法、淋法和蒸法對(duì)枳實(shí)進(jìn)行軟化。結(jié)果表明，蒸法軟化枳實(shí)藥材時(shí)其指標(biāo)性成分含量下降幅度較大，可能由于其高溫的緣故，使枳實(shí)中的有效成分破壞。淋法與浸泡法軟化的枳實(shí)藥材則無(wú)明顯差別，且浸泡法比淋法操作簡(jiǎn)單，容易掌握，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果并考慮到生產(chǎn)實(shí)際確定選擇浸泡法為枳實(shí)藥材的軟化方法。枳實(shí)藥材質(zhì)地堅(jiān)硬，需長(zhǎng)時(shí)間浸潤(rùn)才能潤(rùn)透，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，加水量不宜過(guò)多，以免傷水，軟化藥材時(shí)要以“藥透水盡”為標(biāo)準(zhǔn)。枳實(shí)中有效成分辛弗林及黃酮類(lèi)化合物若長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱，可導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞，有效成分降低，故本實(shí)驗(yàn)枳實(shí)的軟化溫度因素考查范圍規(guī)定為10～30℃［4，5］。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)枳實(shí)切片以后的烘干溫度進(jìn)行了初步試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)樣品在恒溫60℃的烘箱中烘干其有效成分損失不大，但烘干溫度超過(guò)60℃，其有效成分損失很大，其主要原因可能是有效成分發(fā)生變化，故枳實(shí)切制后烘干溫度不宜超過(guò)60℃。本試驗(yàn)認(rèn)為枳實(shí)的軟化方法為浸泡法，具體為每100g藥材使用100mL水，在10℃下，軟化12h。切制方法為橫切，切制厚度為1～2mm，使得枳實(shí)的有效成分損失最小，綜合評(píng)分最高。此種軟化和切制工藝合理可行。本實(shí)驗(yàn)選擇多指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)枳實(shí)的軟化和切制工藝條件，為中藥切制工藝優(yōu)選提供了較為科學(xué)、全面的思路，也符合中醫(yī)藥治療疾病多成分綜合作用的特點(diǎn)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：230.

［2］王文凱，劉紅娜，雷丹.不同炮制方法對(duì)枳實(shí)中柚皮苷和新橙皮苷含量的影響［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，19（6）：50.

［3］賈天柱.中藥炮制學(xué)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008：66-67.

［4］王佳，周家雨，郭軍偉，等.枳實(shí)中辛弗林和橙皮苷的聯(lián)合提取工藝研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2009，21（6）：1058-1060.

［5］李榮，李俊.黃酮類(lèi)化合物藥理活性及其構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2005，9（7）：481-483.