蔣德明， 馬海龍， 古麗斯坦·努爾艾合麥提， 買爾丹·帕力合提

（生命科學(xué)學(xué)院 華東師范大學(xué)，上海 200062）

0 引 言

皮膚是人體抵抗致病菌入侵的第一道防線，時(shí)常與環(huán)境中的各類微生物接觸，同時(shí)皮膚表面又生長著大量的共生細(xì)菌.Gao等人通過分子生態(tài)學(xué)方法對(duì)人體手臂表面共生細(xì)菌群落組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)人體皮膚表面存在著8個(gè)細(xì)菌門，182個(gè)細(xì)菌種的共生細(xì)菌，其中放線菌門（Actinobacteria），厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）共占了94.6%，而葡萄球菌屬（Staphylococcus）的細(xì)菌占了皮膚表面細(xì)菌總數(shù)的11.1%［1］.葡萄球菌即廣泛存在于自然環(huán)境中又定植于人體皮膚表面，對(duì)于健康人群并不致病，但可伴隨“異物”（高分子材料如塑料等）進(jìn)入病人體內(nèi)，并通過粘附形成生物膜，入侵血循環(huán)而致敗血癥等，是醫(yī)院交叉感染的重要來源［2］.其致病性隨細(xì)菌侵入途徑、菌量、毒力及機(jī)體免疫力不同而異［3］.

對(duì)皮膚上正常葡萄球菌群落分布的了解有助于對(duì)人類和動(dòng)物上葡萄球菌相關(guān)的皮膚疾病的致病性認(rèn)識(shí).近年來國外學(xué)者對(duì)皮膚共生葡萄球菌類型分布和抗藥性進(jìn)行了一定的研究，如Hauschild等人通過從食蟲動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物身上分離到197株葡萄球菌菌株，通過分析菌株rpoB和dnaJ基因序列發(fā)現(xiàn)，琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）占總數(shù)的28%，其次為木糖葡萄球菌（S.xylosus）占20.8%，斯氏葡萄球菌（S.stepanovicii）占18.3%［4］.Nagase等人對(duì)7種不同的動(dòng)物和人體皮膚上葡萄球菌的種類分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物皮膚上主要以木糖葡萄球菌和松鼠葡萄球菌（S.sciuri）為主，而在人體皮膚上主要以表皮葡萄球菌（S.epidermidis）為主，說明在動(dòng)物身上和人體身上葡萄球菌分布的類型具有明顯的不同［5］.另外研究發(fā)現(xiàn)，皮膚上葡萄球菌群落的組成差異與皮膚疾病密切相關(guān).如Dekio等人對(duì)患有慢性腿部潰瘍病人的皮膚細(xì)菌群落進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照組正常人皮膚上的細(xì)菌組成相比，金黃色葡萄球菌（S.Aureus）在患者皮膚上的組成比例明顯上升［6］.Gao等人在對(duì)牛皮癬病人傷口皮膚表面的細(xì)菌組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照的正常皮膚細(xì)菌群落比較，其中頭狀葡萄球菌（S.capitis）和山羊葡萄球菌（S.caprae）數(shù)量明顯減少，而八疊葡萄球菌（S.hominis）數(shù)量明顯增加，表皮葡萄球菌的數(shù)量在正常皮膚和傷口皮膚上沒有明顯區(qū)別［7］.

國內(nèi)對(duì)皮膚共生葡萄球菌的類型和抗藥性研究主要集中在醫(yī)院臨床菌株上，如王幫勇等人對(duì)重癥監(jiān)護(hù)病房的患者各類標(biāo)本分離的凝固酶陰性葡萄球菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離的凝固酶陰性葡萄球菌以表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌（S.haemolyticus）為主，菌株對(duì)青霉素、紅霉素和苯唑西林耐藥率最高，分別達(dá)100%、93.44%和91.80%［8］.陳麗陽等人對(duì)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年1～12月檢出的葡萄球菌及藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果臨床標(biāo)本中分離出葡萄球菌796株.藥敏結(jié)果顯示，葡萄球菌對(duì)青霉素G和紅霉素的耐藥率均大于50%，其中耐甲氧西林葡萄球菌對(duì)多種抗菌藥的耐藥性均高于甲氧西林敏感的葡萄球菌，但對(duì)萬古霉素和利奈唑胺的耐藥率為0［9］.但國內(nèi)對(duì)健康人群皮膚上的葡萄球菌基本沒有什么實(shí)質(zhì)上的研究進(jìn)展.因此，健康人群皮膚上的葡萄球菌菌株類型以及對(duì)抗生素的耐藥性等方面還了解得很少.

本文通過采集華東師范大學(xué)在校生皮膚表面的細(xì)菌樣品，通過Baird Parker培養(yǎng)基選擇性分離葡萄球菌屬菌株，通過16S rRNA基因序列分析菌株類型及菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；最后利用紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)葡萄球菌菌株對(duì)10種常見的抗生素敏感性進(jìn)行分析.可在一定程度上了解正常人體表面的葡萄球菌的種類和耐藥狀況，對(duì)于健康人體細(xì)菌的分布、耐藥性研究以及醫(yī)學(xué)上指導(dǎo)臨床合理用藥等都有一定的指導(dǎo)意義.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 在學(xué)校邀請(qǐng)了30位本校學(xué)生，他們都身體健康，且近一個(gè)月內(nèi)沒有服用過抗生素，其中維族15人，漢族15人.提取了他們手背皮膚表面的細(xì)菌樣品，采集方法為用滅菌棉簽沾取取樣液（0.15 mol／L NaCl，0.1%Tween 20）在被采集者的手背擦拭后，將棉簽放入盛有500μL取樣液的離心管中清洗，如此重復(fù)3次獲得皮膚表面細(xì)菌樣品.樣品編號(hào)按照英文字母順序編寫，維族人群樣品用大寫字母；漢族人群樣品用小寫字母.

1.1.2 主要試劑和儀器 基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物有限公司，北京），小量質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生物有限公司，北京），PCR擴(kuò)增儀（Eppendoff，德國），凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad，美國），PCR純化試劑盒（上海生工生物有限公司，上海），穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和電泳槽，離心機(jī)，數(shù)碼相機(jī)，pMD19－T（大連寶生物生物有限公司，大連）載體，大腸桿菌DH5α，藥敏紙片（上海歐韋達(dá)生物技術(shù)有限公司，上海）等.

1.2 葡萄球菌菌株分離

將采集的皮膚表面樣品取100μL涂布于Baird Parker培養(yǎng)基（每100 mL含胰蛋白胨1.0g，牛肉浸粉0.5 g，酵母浸粉0.1 g，丙酮酸鈉1.0g，甘氨酸1.2 g，氯化鋰0.5 g，卵黃亞碲酸鉀增菌劑5 mL，瓊脂1.5 g，pH值7.2）37℃培養(yǎng)48 h.根據(jù)菌落表型不同隨機(jī)選取不同的菌落，接種在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，加入甘油使其終濃度達(dá)到15%，－80℃凍存?zhèn)溆?

1.3 細(xì)菌基因組DNA提取

將－80℃凍存菌株轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h后，取2 mL菌液到離心管中，按照基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細(xì)菌基因組DNA，DNA溶液取5μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.4菌株16S rRNA基因擴(kuò)增，ARDRA分型與測序

使用細(xì)菌通用引物27F和1492R［13］對(duì)78菌株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系（20μL）：2×Premix Taq 10μL，上下游引物（l0μmol／L）各0.5μL，模板DNA100 ng左右.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃4 min，94℃45 s，55℃45 s，72℃90 s，25個(gè)循環(huán)；72℃10min.以無菌水為空白作為陰性對(duì)照，做2個(gè)PCR擴(kuò)增平行實(shí)驗(yàn).取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

對(duì)于分離到的葡萄球菌菌株，利用擴(kuò)增片段限制性酶切（ARDRA）分型方法來確定菌株的類型.PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化和回收，對(duì)純化的PCR產(chǎn)物用Hinf I和Csp6 I進(jìn)行酶切分析.酶切體系20μL：Hinf I或Csp6 I 1μL，10×buffer 2μL，PCR產(chǎn)物8μL，ddH2O6μL.37℃ 酶切4 h后加2μL10×Loading buffer終止反應(yīng).通過瓊脂糖凝膠電泳初步判斷不同菌株類型.

為了克隆菌株16S rRNA基因，純化的PCR產(chǎn)物與pMD19－T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中.轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用煮沸法［14］提取質(zhì)粒，電泳檢測具有目的片段插入的陽性克隆，陽性克隆直接送英俊測序中心測序.

1.5 序列分析和核酸序列收錄號(hào)

陽性克隆利用引物27F和1492R進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果用Contig軟件進(jìn)行拼接，獲得近乎全長的16S rRNA基因序列.16S rRNA基因序列與GenBank中的已知序列進(jìn)行了分析比對(duì)，從GenBank中取得相關(guān)序列作為參考菌株序列，首先使用ClustalX［15］將序列進(jìn)行完全比對(duì)，然后用Neighbor－joining法［16］取得序列的進(jìn)化距離.使用軟件 Mega［17］作出系統(tǒng)進(jìn)化樹，數(shù)據(jù)自展重抽樣次數(shù)1 000次.16S rRNA基因序列進(jìn)化樹以溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）ATCC13548（GenBank序列號(hào)Y15711）作為進(jìn)化樹的根.本實(shí)驗(yàn)中所得到的細(xì)菌16S rRNA基因序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，收錄號(hào)為JN175356－JN175386.

1.6 葡萄球菌菌株抗生素敏感性分析

利用紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)31株分離到的葡萄球菌菌株的抗生素敏感性進(jìn)行檢測，方法見文獻(xiàn)報(bào)道［18］.本研究選用了10種不同類型的常見抗生素來檢測葡萄球菌抗藥性，根據(jù)產(chǎn)生的抑菌圈直徑的大小來確定抗生素抗性情況.選取抗生素和抗性判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：阿米卡星（Amikacin）30μg，R＜14，I＝14～17，S＞17；阿莫西林（Amoxicillin）10μg，R＜28，I＝28～36，S＞36；氨芐西林（Ampicillin）10μg，R＜28，I＝28～29，S＞29；先鋒IV（Cefalexin）30μg，R＜14，I＝14～18，S＞18；氯霉素（Chloromycetin）30μg，R＜12，I＝12～18，S＞18；環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）5μg，R＜15，I＝15～21，S＞21；恩諾沙星（Enrofloxacin）5μg，R＜22，I＝22～28，S＞28；紅霉素（Erythromycin）15μg，R＜13，I＝13～23，S＞23；慶大霉素（Gentamicin）10μg，R＜12，I＝12～15，S＞15；新霉素（Neomycin）30μg，R＜12，I＝12～17，S＞17.上述抗性標(biāo)準(zhǔn)中，R代表具有抗藥性的抑菌圈大小，S代表對(duì)抗生素敏感的抑菌圈大小，I代表處于兩者之間的臨界范圍.

2 結(jié) 果

2.1 菌株基因組DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增

由圖1A中可以看出所提取的基因組DNA片段基本都大于10 kb，并且較為完整，無明顯降解適合用于后續(xù)PCR擴(kuò)增，其中2號(hào)菌株DNA條帶不明顯，又重新進(jìn)行了提取并看到了明顯條帶.細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1B所示，目的片段大小都為1 500 bp左右，并且特異性較好.

圖1 部分菌株提取的基因組DNA（A）和菌株16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果（B）Fig.1 Genomic DNA extracted fromStaphylococci isolated from healthy skin（A）and bacterial 16S rRNA genes amplified by PCR（B）

2.2 菌株16S rRNA基因ARDRA分型

本研究中，首先對(duì)分離得到的葡萄球菌菌株進(jìn)行ARDRA分型，然后選取獨(dú)特類型的菌株進(jìn)行后續(xù)的16S rRNA序列測定和抗生素敏感性分析.經(jīng)過酶切分型后，得到共31株葡萄球菌菌株.部分酶切圖譜檢測結(jié)果如圖2所示，PCR產(chǎn)物酶切條帶均小于1 500 bp，因而認(rèn)為酶切較為充分，并且分辨率較高.酶切圖譜顯示，每一個(gè)人員皮膚細(xì)菌樣品中存在著至少一種以上不同類型的葡萄球菌，最高發(fā)現(xiàn)有3種不同類型的葡萄球菌菌株，隨后將對(duì)這些菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定.

圖2 部分菌株16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的Hinf I酶切圖譜Fig.2 Hinf I restriction patterns of some amplified 16S rRNA genes of Staphylococci strains

2.3 葡萄球菌類型及多樣性分析

經(jīng)過酶切分型以后，共獲得了31株不同類型的葡萄球菌菌株，對(duì)這些菌株的16SrRNA基因序列進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)31株菌株可以分為6個(gè)不同的種（見表1）.其中表皮葡萄球菌有19株，占總數(shù)的61.3%.這些菌株中分離自維族人群有11株，它們來自于10位維族人的樣品，檢出率為66.7%.另外8株分離自漢族人群中，它們來自于8位漢族人的樣品，檢出率為53.3%.金黃色葡萄球菌發(fā)現(xiàn)有3株分別是S.aureus ECNU－UH3，S.aureus ECNU－UK2，S.aureus ECNU－UM4，分離自維族人群樣品 H，K，M 中.金黃色葡萄球菌作為一種致病菌，也可能存在于健康人體皮膚表面但并不會(huì)引起致病，這一結(jié)果與之前Laub等人報(bào)道的結(jié)果一致［19］.腐生葡萄球菌菌株有3株，其中S.saprophyticus ECNUUA1，S.saprophyticus ECNU－UA3，S.saprophyticus ECNU－UF1菌株分離自維族人群樣品A和F中.山羊葡萄球菌菌株有4株，其中S.caprae ECNU－UJ2，S.caprae ECNUUF4菌株分離自維族人群樣品J，F(xiàn)中，而S.caprae ECNU－Hd1，S.caprae ECNU－Hj3分離自漢族人群樣品d，j中.另外巴氏葡萄球菌和孔氏葡萄球菌都只發(fā)現(xiàn)1株菌株，說明在人體皮膚微環(huán)境中存在的數(shù)量較少.

表1 華東師范大學(xué)在校學(xué)生皮膚微環(huán)境中存在的葡萄球菌類型Tab.1 Identification of various staphylococcal strains isolated from human skin samples of East China Normal University students by sequencing 16S rRNA gene

為了分析31株葡萄球菌屬菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，從圖3中可以看出，6種不同的葡萄球菌種都位于各自的進(jìn)化分支內(nèi)，其中金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球有較近的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，而腐生葡萄球菌與表皮葡萄球菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).表皮葡萄球菌都位于同一分支內(nèi)，很多菌株之間的同源性在99%以上；由于表皮葡萄球菌菌株之間16S rRNA基因差異不顯著，無法正確顯示菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，因此有必要考慮用其他持家基因如HSP60等來進(jìn)行進(jìn)一步的分析.

2.4 葡萄球菌菌株抗生素敏感性分析

雖然分離的葡萄球菌是來自健康人的皮膚，屬于人體正常共生細(xì)菌，并且菌樣采自20～24歲的青年，使用抗生素的機(jī)會(huì)不會(huì)很大，但在研究的31株菌中沒有出現(xiàn)一例對(duì)于10種抗生素完全敏感的現(xiàn)象，相反地菌株的多重抗性非常普遍，對(duì)3種及以上抗生素具有抗藥性的概率為81.2%（見表2）.3株金黃色葡萄球菌菌株對(duì)氨芐西林和阿莫西林都具有明顯抗性，而對(duì)環(huán)丙沙星和慶大霉素都敏感.同時(shí)發(fā)現(xiàn)山羊葡萄球菌Hj3除了對(duì)氯霉素和新霉素抗性處于臨界狀態(tài)外其他7種抗生素均具有抗性，只對(duì)阿米卡星敏感的嚴(yán)重耐藥性現(xiàn)象.

從圖4中可以看出，在10種抗生素中，氨芐青霉素，阿莫西林和恩諾沙星3種抗菌效果都較低.其中對(duì)氨芐青霉素敏感的菌株只有3株菌株，分別是表皮葡萄球菌UE2，UI5和腐生葡萄球菌UA1.對(duì)阿莫西林敏感的菌株并沒有發(fā)現(xiàn)，且只有3株菌株對(duì)其敏感性處于臨界范圍.對(duì)恩諾沙星敏感的菌株并沒有發(fā)現(xiàn)，但有9株菌株對(duì)其敏感性處于臨界范圍.阿米卡星的抗葡萄球菌效果最好，在31株菌株中只有3株菌株對(duì)阿米卡星有抗性，它們分別是表皮葡萄球菌UK5，UJ1和金黃色葡萄球菌UK2.其次是新霉素，抗藥性在3.1%，只有表皮葡萄球菌Hh2對(duì)其敏感，但有11株菌株對(duì)新霉素的敏感性處于臨界范圍.環(huán)丙沙星，氯霉素和先鋒IV的抗藥性則處于較低水平，為9%～20%之間.慶大霉素和紅霉素的抗藥性處于中等水平，分別為21.9%和31.3%.

圖3 31株葡萄球菌及對(duì)照菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 The phylogenetic tree constructed by the 16S rRNA gene sequences of the 31 Staphylococcus strains and references

表2 分離自華東師范大學(xué)在校學(xué)生皮膚微環(huán)境的葡萄球菌菌株對(duì)抗生素的抗藥性Tab.2 Antibiotic susceptibility of Staphylococcus strains isolated from healthy human skin samples of East China Normal University students

圖4 31株葡萄球菌菌株對(duì)10種抗生素的耐藥率Fig.4 Antibiotic resistance of 31 Staphylococcus strains against 10 different antibiotics

3 結(jié) 論

通過對(duì)華東師范大學(xué)在校學(xué)生的皮膚上葡萄球菌的類型分析，發(fā)現(xiàn)手背皮膚上主要以表皮葡萄球菌為主，而巴氏葡萄球菌和孔氏葡萄球菌都只發(fā)現(xiàn)1株菌株，說明在這些皮膚細(xì)菌樣品中存在的數(shù)量較少.在這些皮膚細(xì)菌樣品中有一半來自于維族人，一半來自于漢族人，結(jié)果顯示在兩個(gè)民族的皮膚細(xì)菌樣品中，維族人群樣品中分離的葡萄球菌數(shù)量較多，但沒有發(fā)現(xiàn)顯著的菌株類型的不同.由于采集的樣品數(shù)量有限，而且在校維族學(xué)生已在滬生活最少1年以上，沒有辦法采集真正生活在新疆的維族人的皮膚菌樣，所以兩種民族皮膚葡萄球菌菌種真正的差別仍需要深入研究.

在葡萄球菌的測序結(jié)果中得到的菌種多數(shù)為表皮葡萄球菌，而進(jìn)化樹顯示雖屬同一個(gè)種但得到的表皮葡萄球菌同源性的差異也比較大，有的同源性非常近（＞99%），有的則存在比較大的差異.而從進(jìn)化樹中也可以看出同屬于葡萄球菌屬的幾種葡萄球菌之間的親緣關(guān)系.但對(duì)于同一種類的菌株來看，由于16S rRNA基因差異不顯著，無法得出正確的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，可能需要對(duì)其他持家基因進(jìn)行分析.縱覽整個(gè)進(jìn)化樹可以看出金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球有較近的親緣關(guān)系，而腐生葡萄球菌與表皮葡萄球菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

在抗生素敏感性的檢測中，發(fā)現(xiàn)雖然所采集的細(xì)菌來自健康人的皮膚，但其對(duì)于抗生素的耐藥性仍然很強(qiáng)，氨芐青霉素、阿莫西林和恩諾沙星3種抗菌效果都比較低，阿米卡星的抗葡萄球菌效果最好，在31株菌株中只有3株菌株對(duì)阿米卡星有抗性.

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