張坤智， 蘇明波，， 周宇波

（1.華東師范大學 生命科學學院，上海 200062；2.國家新藥篩選中心，上海 201203）

0 引 言

IRE1是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的單次跨膜蛋白，具有絲氨酸／蘇氨酸激酶和核酸酶雙重功能，是未折疊蛋白應答（UPR，unfolded protein response）中進化最保守、最重要的通路［1］.IRE1蛋白一方面可以感知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，使激酶區(qū)域自磷酸化進而激活核酸酶活性，在mRNA水平上剪切其下游轉(zhuǎn)錄因子XBP1［2］.另一方面，激活的IRE1還可以通過不依賴于XBP1的途徑，招募JNK，進而引發(fā)細胞凋亡［3］.

IRE1作為激酶／核酸酶雙功能酶，其激酶與核酸酶之間的關系為人們所關注.有的研究認為IRE1激酶自身磷酸化對IRE1核酸酶的活性是必需的［4］；有研究認為IRE1核酸酶活性與激酶活性的有無之間沒有必然聯(lián)系［5］，還有一些研究認為抑制IRE1激酶的活性反倒能夠激活其核酸酶活性［6］.到底IRE1激酶與核酸酶之間有怎樣的聯(lián)系，尚不甚清楚.

IRE1參與調(diào)解機體的許多生理功能，在細胞的生長、分化、代謝等諸多生命活動中起著很重要的作用.活化的IRE1參與胰高血糖素對肝臟多種代謝途徑的調(diào)節(jié)，抑制IRE1通路則顯著改善血糖水平并提高機體的葡萄糖耐受能力［7］，整個過程與XBP1無關，提示IRE1激酶活性可能參與這一調(diào)控.最新的報道則指出IRE1依賴于其激酶活性促進突變型亨廷頓蛋白的積累，從而加重亨廷頓舞蹈癥［8］.IRE1在腫瘤低氧、低糖的微環(huán)境中促進了血管內(nèi)皮生長因子的表達，擴張腫瘤血管使得惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤能持續(xù)生長［9，10］.但這一過程究竟是IRE1激酶還是IRE1核酸酶發(fā)揮作用，尚不清楚.

基于以上所述，IRE1不僅具有重要的生理功能，而且與包括代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等重大疾病有著密切關系，但目前在IRE1化學生物學方面的研究工作特別是IRE1激酶抑制劑研究還非常少，極大程度的限制了進一步準確理解IRE1生理功能及其與疾病的關系研究.IRE1激酶小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)，不僅對驗證IRE1激酶活性與疾病關系及潛在的藥物發(fā)現(xiàn)及其作用機理提供研究思路與平臺，也對闡明激酶與核酸酶之間的關系也提供了研究工具.本項目擬從IRE1激酶活性調(diào)控入手，建立體外的IRE1激酶抑制劑高通量篩選模型，為進一步發(fā)現(xiàn)IRE1激酶抑制劑奠定堅實基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

質(zhì)粒IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP（Genbank Number：NM＿001433.3）購自 Addgene公司，pFAST－Bac1來自本實驗室保存，大腸桿菌JM109和DH5α來自本實驗室保存，各種限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶以及PCR試劑為Takara公司產(chǎn)品，PCR回收以及膠回收試劑盒為Axygene產(chǎn)品，PCR管購自Promega公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自TIANGEN公司、OMEGA公司以及Nucleobond公司，Sf9和Hi－5細胞來自本實驗室保存，轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin購自Invitrogen公司，Bluo－gal IPTG，GIBCO Grace昆蟲培養(yǎng)基，Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，GIBCO胎牛血清，sf－900ⅡSFM昆蟲培養(yǎng)基均購自Invitrogen公司，HTRF試劑盒購自Cisbio公司，白色384圓孔板購于PE公司，星形孢菌素（sc－3510A）購于Santa Cruz公司，顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品，型號：IX51，呈像系統(tǒng)為Image－Pro Plus AMS.

1.2 儀器

測序由博尚公司完成，PCR儀購自PERKIN ELMER公司，NANO Drop 1000購自Thermo公司，搖床購自Forma Scientific公司，由分光光度儀購自Pharmacia Biotech公司，水浴鍋為精宏公司產(chǎn)品，常溫離心機為Thermo公司產(chǎn)品，4℃離心機購自eppendorf公司，4℃高速大型離心機購自HITACH公司，超聲破胞儀購自寧波科生儀器廠，KARMA NiSepharose 6FF購自業(yè)力生物，Envision購自Perkin Elemer公司，機器加樣器為Beckman公司出品.

1.3 重組基因的構(gòu)建

1.3.1 目的基因的擴增

以質(zhì)粒IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP為模板，上游引物：AATTGAATTCCCATGATCACCTATCCCCTGAGCATGCA；下游引物：TATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGAGGGCGTCTGGAGTCACTGG；在上下游引物分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切切點，同時在下游引物中引入了6×His標簽.引物由上海生工生物工程公司合成.PCR反應參數(shù)為95℃預變性5 min，95℃變性45 s，56℃變性30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min.

PCR擴增模板的1 384位到2 931位［11］，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測.

1.3.2 目的基因的酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及克隆鑒定

參照Invitrogen公司網(wǎng)站提供的Bac－to－bac TOPO Expression System說明書，將目的基因經(jīng)特異性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后連接到pFAST－Bac1質(zhì)粒載體上，測序無誤后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株，抽提出IRE1－pFAST－Bac1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到DH10BacTM菌株中，在含有通過慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、X－gal和IPTG的平板上培養(yǎng)，經(jīng)藍白斑篩選挑出白斑，提取質(zhì)粒，引入M13引物通過PCR方法分析產(chǎn)物的長度來檢驗目的片段是否成功插入［12］.PCR反應參數(shù)為95℃預變性5 min，95℃變性45 s，56℃變性30 s，72℃延伸2.5 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min.

1.4 昆蟲細胞的培養(yǎng)

在昆蟲細胞培養(yǎng)基Sf－900Ⅱ中加入青霉素50 kU／L、鏈霉素50 mg／L以及10%的胎牛血清，在無CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Sf9細胞，培養(yǎng)細胞三代至穩(wěn)定，才可用于桿狀病毒復制.

在昆蟲細胞培養(yǎng)基GIBCO GRACE中加入青霉素50 kU／L、鏈霉素50 mg／L、2.5%的胎牛血清和18 mmol／L的Glutamin，在無CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Hi－5細胞，培養(yǎng)細胞3代至穩(wěn)定，才可用于桿狀病毒侵染和重組蛋白的表達.

1.5 重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細胞、重組桿狀病毒的包裝和獲得以及重組桿狀病毒侵染Hi－5細胞

當Sf9細胞長至密度約80%且生長狀態(tài)良好時，按照CellFectin（Invitrogen）轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將重組的桿粒DNA轉(zhuǎn)染到Sf9細胞中.3 d后觀察到Sf9細胞核內(nèi)容物變多，核變大，核折光性增強、細胞貼壁不牢等現(xiàn)象時，將細胞吹打下來，并轉(zhuǎn)移至離心管中，800 r／min×3 min離心，收取上清為第一代重組桿狀病毒，用于進一步感染Sf9細胞并擴增病毒.

當Hi－5細胞在直徑為20 cm的培養(yǎng)皿中長至密度大于80%時，將擴增的病毒感染Hi－5細胞，當Hi－5細胞出現(xiàn)核變大，貼壁不牢并成團漂浮起來等現(xiàn)象時，將細胞吹打下來，轉(zhuǎn)移到30 mL離菌管中，4℃離心，6 000 r／min×5 min，收集細胞.

1.6 目的蛋白hIRE1α（462 aa—977 aa）［11］的表達純化

hIRE1α胞內(nèi)段含有激酶以及核酸酶結(jié)構(gòu)域，選取462位至977位的氨基酸，包含了激酶、核酸酶結(jié)構(gòu)域以及一部分跨膜區(qū)段.

上一步收集的細胞用4℃預冷的裂解緩沖液（25 mmol／LTris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1%Triton－X100，1 mmol／Lβ－巰基乙醇）重懸；后置于冰上，超聲裂解（超聲1 s，間隔1 s，強度45%，時間120 s，超聲裂解至鏡下觀察無明顯的團狀細胞）；4℃，12 000 r／min×15 min，離心至管壁上沒有白色物質(zhì)沉積，收集上清.

取1 mL Ni－beads，4℃，1 000 r／min×1 min離心，棄去上清，用平衡緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇）重懸beads，4℃，1 000 r／min×1 min離心，棄去上清；取裂解步驟中收集到的上清，與平衡過的beads混合，4℃搖晃輕柔孵育2 h.

孵育后的的上清倒于5 mL管柱，穿透（flowthrough）流出，beads連同結(jié)合的蛋白沉在管柱底部.用5 mL含0mmol／L 咪唑的緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油）緩慢潤洗beads，后用含50 mmol／L咪唑的除雜緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇，50 mmol／L 咪唑）緩慢潤洗beads，不斷吸取20μL流出的液體滴入預先準備好的180μL G250中，至G250不顯示藍色，則認為雜蛋白清除干凈.

雜蛋白清除干凈后，每次用500μL含250 mmol／L咪唑的洗脫緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘 油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇，250 mmol／L咪唑）洗脫目的蛋白，間斷吸取20μL流出的蛋白液體滴入預先準備好的180μL G250中，至G250不顯示藍色，則認為目的蛋白已洗脫盡.

預先準備好脫鹽緩沖液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巰基乙醇）置于4℃預冷，蛋白置于脫鹽緩沖液中，4℃輕柔旋轉(zhuǎn)過夜以達到去除咪唑的目的.透析脫鹽后的蛋白，測定濃度之后，分裝并凍存于－80℃.

上清、沉淀、目的蛋白、Flowthrough、雜蛋白以及目的蛋白與2×loading buffer等體積混合，100℃煮樣10 min，用以聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）檢測.

1.7 目的蛋白活性的檢測

采用HTRF（Homogeneous Time－resolved Fluorescence）激酶測活方法.在 HTRF試劑盒中，S2是一段含有磷酸化位點的肽段，可被IRE1激酶識別并磷酸化.參照試劑盒推薦的反應時間，底物與蛋白30℃孵育1 h，加入抗體和染料，30℃孵育1 h后，熒光檢測儀Envision在405 nm的激發(fā)波長下，檢測620 nm和665 nm的兩個發(fā)射波長下產(chǎn)物的熒光信號，并通過兩個發(fā)射波長下熒光信號的比值來判定酶活性的強弱.同時設置空白對照來判定酶活性的有無以及強弱.

1.8 IRE1激酶抑制劑高通量篩選體系的建立

1.8.1 酶、底物以及DMSO濃度的確定

依照激酶測活HTRF法，底物S2濃度暫定為800 nmol／L，ATP暫定為50μmol／L，酶自最高濃度逐步稀釋，同時設置酶的空白對照.根據(jù)熒光讀值，繪制酶促反應曲線，綜合考慮酶和空白對照的窗口值以及反應速度的線性范圍，來確定酶促反應的合適酶濃度.

眾所周知，Km即是酶促反應達到最大反應速度一半時的底物濃度.因為本文的反應是S2與ATP雙底物，故測定一個底物的Km值時，需先使另一種底物過量，然后做出相應底物的不同濃度對應的反應速度（即HTRF signal），通過回歸計算，最終獲得最大反應速度一半時的底物濃度，即Km值.

在上述酶與底物合適的濃度下，檢測DMSO濃度對于酶活性的影響.

1.8.2 高通量篩選體系的評價

在白色384圓孔板中評價篩選體系是否符合高通量篩選的要求.陰性對照為之前一步確定的各種組分，陽性對照是在陰性對照的組分中加入100 nmol／L的星型孢菌素（STS，staurosporine，廣譜的激酶抑制劑）.陽性、陰性對照各占板面積的1／2.

Z′因子是被廣泛用于評價高通量篩選體系是否合格的的參數(shù)指標，用來評估反應體系的準確性和穩(wěn)定性的［13］.根據(jù)公式：Z′因子＝1－3（SDneg＋SDpos）／（Mneg－Mpos），其中SDneg和Mneg分別代表陰性對照相對熒光強度的標準差和平均值；SDpos和Mpos分別代表陰性對照相對熒光強度的標準差和平均值.

CV（變異系數(shù)，coefficient of variation），是標準偏差與平均值之比，用百分數(shù)表示，即CV＝SD／mean×100%，用以衡量篩選體系的相對偏差.

1.8.3 廣譜的激酶抑制劑星型孢菌素在高通量篩選模型上的評價

星型孢菌素（STS）是ATP競爭性抑制劑，廣泛抑制激酶的活性，在確定的高通量篩選酶促反應體系中評價STS是否有抑制作用.

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的擴增以及IRE1－pFAST－Bac1重組質(zhì)粒的制備

從IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP質(zhì)粒中擴增目基因.hIRE1α（nt 1384—nt 2931）共有1 548個堿基，加上前后引物共有1 638個堿基.對比marker，PCR擴增如出現(xiàn)大小接近，且單一濃密的條帶即證明擴增成功（見圖1）.

圖1 人源IRE1α（nt 1384—nt 2931）基因片段擴增瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR結(jié)果Fig.1 Results of PCR fragment of hIRE1α（nt 1384—nt 2931）detected by agarose electrophoresis

上一步擴增出的目的基因經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，挑單克隆，抽取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒IRE1－pFAST－Bac1經(jīng)雙向測序無誤后，轉(zhuǎn)化到DH10BacTM菌株中，經(jīng)藍白斑篩選挑出白斑，提取質(zhì)粒，采用引物M13，進行PCR擴增，若目的基因成功插入則能擴增出大小小約2 100 bp的條帶，包含約1 600 bp的目的基因和約500 bp的載體片段；反之，則未能得到重組桿粒.結(jié)果顯示，約2 100 bp處有清晰的條帶，說明重組桿粒（命名為BacMid－IRE1）成功制備（見圖2）.

圖2 BacMid－IRE1質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Fig.2 Results of BacMid－IRE1 detected by agarose electrophoresis

2.2 重組桿粒對Sf9和hi－5細胞的感染

未經(jīng)重組桿粒感染的對照組Sf9細胞貼壁牢固（見圖3A），而感染了重組桿狀病毒的Sf9細胞，當細胞直徑增加，核變大，核內(nèi)容物變多，細胞貼壁不牢時（見圖3B），離心收取病毒用以后續(xù)病毒侵染.圖中標尺長度代表50μm.

重組的桿狀病毒進一步侵染Hi－5細胞，與未經(jīng)重組桿狀病毒侵染的對照組相比（見圖4A），當細胞直徑增大，細胞核內(nèi)容物明顯變多變雜，細胞也有明顯的脫落時（見圖4B），離心收取細胞用于表達純化.圖中標尺長度代表100μm.

圖3 正常狀態(tài)下的Sf9細胞（A）和受重組桿狀病毒侵染72 h之后的Sf9細胞（B）Fig.3 Uninfected Sf9（A）cells and Sf9 cells infected with recombinant baculovirus（B）

2.3 目的蛋白hIRE1α（462aa—977aa）的獲得

將經(jīng)過Ni－Beads純化的hIRE1α（462 aa—977aa）經(jīng)過SDS－PAGE檢測，結(jié)果顯示：SDS－PAGE膠圖經(jīng)過考馬斯亮藍染色之后，55 kD出呈現(xiàn)清晰且單一的條帶，大小與預期（56 kD）相符，表明hIRE1α（462 aa—977aa）在昆蟲細胞中獲得正確的表達（見圖5）.因為有柱體積的殘留，圖5中l(wèi)ane 6為除雜后用250 nmol／L咪唑第一次洗脫下的蛋白，可見雜蛋白并未完全除凈，lane 7—8為250 nmol／L咪唑后續(xù)洗脫下的蛋白，可見雜蛋白已基本除凈.

圖4 正常狀態(tài)下的Hi－5細胞（A）和受重組桿狀病毒侵染72 h之后的Hi－5細胞（B）Fig.4 Uninfected Hi－5（A）cells and Hi－5 cells infected with recombinant baculovirus（B）

圖5 SDS－PAGE分析純化的hIRE1α蛋白（462aa—977aa）Fig.5 The purified hIRE1αprotein（462aa—977aa）analyzed by SDS－PAGE

純化的hIRE1α經(jīng)測定，濃度測定為125μg／mL（約為2μmol／L）；SDS－PAGE結(jié)果經(jīng)凝膠薄層掃描鑒定純化的hIRE1α蛋白純度約為85%.

2.4 IRE1激酶抑制劑高通量篩選體系的確定

底物S2濃度暫定為800 nmol／L，ATP暫定為50μmol／L，酶自最高濃度逐步稀釋，同時設置酶的空白對照，選取酶促反應在線性范圍內(nèi)且窗口合適的酶濃度，根據(jù)酶活性曲線，選取了25 nmol／L作為合適的酶濃度.與空白對照相比，窗口值約為15倍（見圖6）.

確定酶濃度為25 nmol／L，設定底物ATP濃度為200μmol／L使其在酶促反應中飽和，逐步稀釋底物S2，通過回歸計算，得出底物S2的Km值為300 nmol／L（見圖7）.

確定底物S2的的濃度為300 nmol／L，選擇其濃度為2μmol／L使其在酶促反應中飽和，逐步稀釋底物ATP，通過回歸計算，得出底物ATP的Km值為16μmol／L（見圖8）.

圖6 不同濃度的IRE1激酶活性Fig.6 Kinase activity of different concentrations of IRE1

圖7 不同濃度的底物S2對IRE1激酶催化反應的影響Fig.7 Effect of concentrations of S2on the enzymatic reaction catalyzing by IRE1 kinase

圖8 不同濃度的ATP對IRE1激酶催化反應的影響Fig.8 Effect of concentrations of ATP on the enzymatic reaction catalyzing by IRE1 kinase

過高的DMSO會對IRE1激酶活性產(chǎn)生影響，考察了4%、2%、1%和0%4個DMSO濃度（見圖9），發(fā)現(xiàn)4%的DMSO濃度已經(jīng)對IRE1激酶活性產(chǎn)生了20%的抑制；此外化合物溶解在DMSO中，隨著DMSO濃度的降低，化合物的溶解性也會降低.綜合兩方面的因素，選擇2%DMSO作為篩選條件.

2.5 高通量篩選模型的檢測和陽性抑制劑的評價

用Z′因子和CV值來檢測高通量篩選模型是否合格.一般認為，當Z′因子的值大于0.5且CV值小于10%時，才能高通量進行篩選.本模型Z′因子等于0.58，CV值等于7.5%，故認為本優(yōu)化條件符合高通量篩選要求.

圖9 不同濃度的DMSO對IRE1激酶催化反應的影響Fig.9 IRE1 kinase activity in different concentrations of DMSO

星型孢菌素是激酶的廣譜性抑制劑，本文在本模型上檢測了其對激酶的抑制作用，并且測得其IC50＝（13.83±3.9）nmol／L，與文獻報道的（13±8.4）nmol／L相近［14］（見圖10）.

圖10 星型孢菌素抑制IRE1激酶活性的IC50＝（13.83±3.9）nmol／LFig.10 Concentration－dependent inhibition of IRE1 kinase activity by Staurosporine（IC50＝（13.83±3.9）nmol／L）

3 討 論

體外分子水平實驗模型常用于針對單靶點的藥物發(fā)現(xiàn)，因其較容易進行高通量的篩選，近年來，分子篩選模型針對小分子抑調(diào)節(jié)劑劑的篩選被廣泛用于新藥發(fā)現(xiàn).IRE1分子量較大，翻譯后修飾較復雜，而昆蟲表達系統(tǒng)具有真核表達系統(tǒng)的翻譯后加工功能，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，更適用于高通量篩選，故選用昆蟲表達系統(tǒng)進行蛋白表達.結(jié)合Bac－to－Bac桿狀病毒系統(tǒng)，成功構(gòu)建出桿狀病毒的穿梭質(zhì)粒并獲得了高純度的IRE1蛋白（見圖3）.同時，相對于文獻，引入His標簽使得蛋白純化更為簡便快捷.

藥物篩選是新藥發(fā)現(xiàn)的最初階段，高通量藥物篩選具有速度快、效率高、成本低等諸多優(yōu)點.實驗中發(fā)現(xiàn)部分樣品具有激活IRE1激酶的作用，將本篩選模型適當改進也可作為IRE1激酶激活劑的篩選模型進行使用.

HTRF（Homogeneous Time－resolved Fluorescence），結(jié) 合 了 熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移（FRET，F(xiàn)luorescence Resonance Energy Transfer）和時間分辨熒光（TRF，Time Resolved Fluorescence）是近年來公認并廣泛用于檢測蛋白分子激酶活性的一項成熟的技術(shù)［15］，HTRF技術(shù)以熒光信號取代了同位素信號，能較準確反映出激酶的活性.本研究采用HTRF技術(shù)測定IRE1激酶和化合物的相互作用，建立高通量的IRE1激酶抑制劑篩選模型，為相關的基礎研究和新藥發(fā)現(xiàn)奠定了堅實的基礎.除了HTRF法之外，目前廣泛使用的激酶測活方法還有 ADP－GLO［16］、Z′－LYTE［17］以及P32等方法.其中 ADP－GLO的測活原理是：激酶反應過程中消耗ATP產(chǎn)生ADP，激酶反應終止后，加入與酶促反應等體積的ADPGLO將反應產(chǎn)生的ADP轉(zhuǎn)化為ATP，這些ATP被熒光素酶轉(zhuǎn)化為光信號，信號強弱與激酶活性呈正相關.但是此方法也有不足之處：化合物有可能是抑制了熒光素酶的活性而使信號降低，這就很容易在篩選中造成假陽性.Z′－LYTE法也是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，可檢測絲氨酸／蘇氨酸、酪氨酸激酶的活性.當激酶反應發(fā)生時，標記了熒光共振基團的部分底物被磷酸化，而未被磷酸化的底物則被位點特異性的蛋白酶識別并且剪切，這種剪切破壞了熒光供體和熒光受體之間的能量轉(zhuǎn)移，使其顯示出較高的發(fā)射比（供體熒光基團激發(fā)后供體發(fā)射和受體發(fā)射的比率），未被剪切的底物熒光供體和受體之間保持很低的發(fā)射比.發(fā)射比在一定波長的激發(fā)光下被檢測到，信號強弱與激酶活性呈反比.但其也有不足之處：在實驗過程中需要設置0%和100%磷酸化率兩個內(nèi)參，并且線性范圍小，這些因素為高通量篩選的質(zhì)控帶來不便.同位素P32測活方法是最經(jīng)典的激酶測活方法，可以準確地反映出底物磷酸化的程度，并帶來靈敏的信號窗口，但同位素很容易造成環(huán)境污染等一系列問題，且成本較高，實驗操作也不便利.較之各種測活方法，HTRF因其靈敏度高、液體均相、操作簡單、成本較低、對環(huán)境危害小等特點，故被選用.

作為IRE1激酶抑制劑的篩選模型，選用的實驗條件既要照顧實驗成本，又要是測定值足夠大，并有較大的信號窗，并且需要保證藥物的作用處于可檢測的線性范圍之內(nèi).本研究基于HTRF建立的IRE1激酶抑制劑高通量篩選模型使用Biomek FX自動化加樣系統(tǒng)以保證實驗的均一性以及準確性，在每塊用于篩選的實驗板上均設立空白和對照，檢測每塊板上的Z′因子和CV值，測定結(jié)果可信度高.

星型孢菌素是廣譜的激酶抑制劑，據(jù)本模型測定該化合物對于IRE1激酶抑制作用的IC50為（13.83±3.9）nmol／L，與文獻報道的（13±8.4）nmol／L相近，證明本實驗方法較為可信，適宜進行高通量篩選.

IRE1激酶相關小分子調(diào)節(jié)劑的研究僅有零星報道，在大規(guī)模的藥物篩選中未見到.隨著更高密度微孔板、自動化液體處理系統(tǒng)、洗板機的聯(lián)合使用，有望將本模型的篩選通量進一步提高，以滿足當前對化合物篩選的更高要求.

［1］ RON D，HUBBARD S R.How IRE1 reacts to ER stress［J］.Cell，2008，132（1）：24－26.

［2］ BACK S H，SCHRODER M，LEE K，et al.ER stress signaling by regulated splicing：IRE1／HAC1／XBP1［J］.Methods，2005，35（4）：395－416.

［3］ ZHANG K，KAWAUCHI J，ADACHI M T，et al.Activation of JNK and transcriptional repressor ATF3／LRF1 through the IRE1／TRAF2 pathway is implicated in human vascular endothelial cell death by homocysteine［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，289（3）：718－724.

［4］ TIROSPHORON W，WELIHINDA A A，KAUFMAN R J.A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase／endoribonuclease（Ire1p）in mammalian cells［J］.Genes Dev，1998，12（12）：1812－1824.

［5］ PAPA F R，ZHANG C，SHOKAT K，et al.Bypassing a kinase activity with an ATP－competitive drug［J］.Science，2003，302（5650）：1533－1537.

［6］ HAN D，UPTON J P，HAGAN A，et al.A kinase inhibitor activates the IRE1alpha RNase to confer cytoprotection against ER stress［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，365（4）：777－783.

［7］ MAO T，SHAO M L，QIU Y F，et al.PKA phosphorylation couples hepatic inositol－requiring enzyme 1alpha to glucagon signaling in glucose metabolism［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（38）：15852－15857.

［8］ LEE H，NOH J Y，OH Y，et al.IRE1 plays an essential role in ER stress－mediated aggregation of mutant huntingtin via the inhibition of autophagy flux［J］.Hum Mol Genet，2012，21（1）：101－114.

［9］ DROGAT B，AUGUSTE P，NGUYEN D T，et al.，IRE1 signaling is essential for ischemia－induced vascular endothelial growth factor－A expression and contributes to angiogenesis and tumor growth in vivo［J］.Cancer Res，2007，67（14）：6700－6707.

［10］ AUF G，JABOUILLE A，GUERIT S，et al.Inositol－requiring enzyme 1alpha is a key regulator of angiogenesis and invasion in malignant glioma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（35）：15553－15558.

［11］ VOLKMANN K，LUCAS J L，VUGA D，et al.Potent and selective inhibitors of the inositol－requiring enzyme 1 endoribonuclease［J］.J Biol Chem，2011，286（14）：12743－12755.

［12］ WALSH D.Cloning PCR products for sequencing in M13 vectors［J］.Methods Mol Biol，2003，226：385－392

［13］ IVESEN P W，EASTWOOD B J，SITTA G，et al.A comparison of assay performance measures in screening assays：signal window，Z’factor，and assay variability ratio［J］.Journal of Biomolecular Screening，2006，11（3）：247－252.

［14］ ALI M M，BAGRATUNI T，DAVENPORT E L，et al.Structure of the Ire1 autophosphorylation complex and implications for the unfolded protein response［J］.Embo J，2011，30（5）：894－905.

［15］ HABERT C，MARSHALL J，SOH S，et al.Development of a HTRF kinase assay for determination of Syk activity［J］.Curr Chem Genomics，2008（1）：20－26.

［16］ ZEGZOUTI H，ZDANOVSKAIA M，HSIAO K，et al.ADP－Glo：A Bioluminescent and homogeneous ADP monitoring assay for kinases［J］.Assay Drug Dev Technol，2009，7（6）：560－572.

［17］ KORESAWA M，OKABE T.High－throughput screening with quantitation of ATP consumption：a universal nonradioisotope，homogeneous assay for protein kinase［J］.Assay Drug Dev Technol，2004，2（2）：153－160.