高君 王志華 于德水 辛穎 丁穎

我們對(duì)A-NK及NA-NK細(xì)胞體外擴(kuò)增情況進(jìn)行觀察，然后用A-NK/IL-2局部或全身應(yīng)用進(jìn)行體內(nèi)的抗腫瘤治療實(shí)驗(yàn)，并與NA-NK進(jìn)行了比較。結(jié)果局部應(yīng)用A-NK/IL-2治療比NA-NK/IL-2有更強(qiáng)的抑瘤作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和培養(yǎng)液

1.1.1 完全培養(yǎng)液(CM) 分離制備的A-NK和NA-NK細(xì)胞均采用RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.1.2 重組IL-2 南京軍事醫(yī)學(xué)研究所研制10萬(wàn)IU/2 ml所用25 cm2和75 cm2培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板均為美國(guó)Costar產(chǎn)品。

1.2 腫瘤細(xì)胞 惡性纖維肉瘤S180(腹水型)，由本實(shí)驗(yàn)室反復(fù)傳代而建立，皮下接種于昆明純系小白鼠;

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明純系小白鼠，本研究所動(dòng)物室傳代和繁殖，6～8周齡雌性，平均體重16～18 g;嚴(yán)格按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作。

1.4 小鼠脾細(xì)胞分離和制備A-NK和NA-NK細(xì)胞 按照Hegenaars 98年的方法，無(wú)菌取鼠脾，過(guò)200目鋼網(wǎng)，研磨成單細(xì)胞懸液，將所得單細(xì)胞懸液加入尼龍毛柱中，在37℃5%C02培養(yǎng)箱中孵育45 min，以去除B細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞。用預(yù)溫37℃的完全培養(yǎng)液輕輕沖洗尼龍毛柱，收集未粘附尼龍毛的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)成2×106/ml，置于塑料培養(yǎng)瓶中水平培養(yǎng)24 h后，移去含未粘附塑料表面的細(xì)胞懸液(此即NA-NK細(xì)胞)，收集粘附于塑料表面的細(xì)胞(即A-NK細(xì)胞)，二者分別重懸于含50%自體條件培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增。

1.5 細(xì)胞體外擴(kuò)增情況的觀察 將A-NK或NA-NK細(xì)胞以1×106/ml的深度加入6孔板，2 ml/孔，設(shè)三個(gè)復(fù)孔，定期換液，每隔三天計(jì)數(shù)一次，取三孔均值。

以0.4%臺(tái)盼蘭(Trypan Blue)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，以1:l比例將臺(tái)盼蘭與單個(gè)細(xì)胞懸液混和，室溫中放置2 min，加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，鏡下觀察細(xì)胞活力和進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染成蘭色。

公式如下:

1.6 腫瘤細(xì)胞動(dòng)物接種 荷瘤小鼠待腫瘤長(zhǎng)至1～3 cm(14 d左右)，斷頸處死。無(wú)菌條件下取出皮下腫瘤，生理鹽水沖洗后，將腫瘤組織剪碎研磨，過(guò)鋼網(wǎng)濾過(guò)。離心(1000rpm，5 min)去上清，生理鹽水稀釋為單細(xì)胞懸液，光鏡下計(jì)數(shù)，稀釋至1×106個(gè)/ml。用l ml注射器吸取腫瘤細(xì)胞混懸液0.2 ml(2×105個(gè)細(xì)胞)，注射至每只小鼠背部皮下，待腫瘤可以觸及，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.7 A-NK體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 昆明小白鼠皮下接種Sl80惡性纖維肉瘤細(xì)胞1×105/只，荷瘤3 d后分別給每個(gè)小鼠局部注射IL-2 1000pIU/只/天，荷瘤5 d后將小白鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，I組為空白對(duì)照，Ⅱ組為A-NK/IL-2尾靜脈注射(全身治療)，Ⅲ組為NA-NK/IL-2局部注射，IV組為ANK/IL-2局部注射組。治療組效應(yīng)細(xì)胞數(shù)為5×106/只/次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 依據(jù)數(shù)據(jù)性質(zhì)的不同，分別采用方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A-NK與NA-NK體外擴(kuò)增情況 如表1所示。A-NK在第10天達(dá)到增殖高峰，NA-NK于第7天達(dá)到增殖高峰。A-NK細(xì)胞增加16.08倍，NA-NK細(xì)胞增加3.36倍。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，A-NK擴(kuò)增指數(shù)均高于NA-NK。

表1 A-NK與NA-NK增殖情況的比較

2.2 局部注射效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤作用和對(duì)照組相比，局部注射組(Ⅲ組和IV組)有明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用(P＜0.05)，尾靜脈注射組(Ⅱ組)治療效果不明顯(P＞0.05)，其中A-NK比NA-NK的抑瘤效果更明顯。

表2 A-NK與NA-NK局部注射的抗腫瘤作用

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)證明A-NK體外擴(kuò)增指數(shù)高于NA-NK。A-NK細(xì)胞具有較高的體外增殖能力和細(xì)胞毒活性，并且能夠浸潤(rùn)到實(shí)體瘤內(nèi)部殺傷腫瘤細(xì)胞，是非常有潛力的理想的效應(yīng)細(xì)胞。白細(xì)胞介素2(IL-2)是一種由133個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，通過(guò)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的受體而起作用。IL-2可增加殺傷性淋巴細(xì)胞毒性，誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞的生成，促進(jìn)B細(xì)胞增生和分泌免疫球蛋白，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6等的分泌［1］。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明:局部應(yīng)用A-NK/IL-2細(xì)胞比NA-NK/IL-2細(xì)胞有更強(qiáng)的抑瘤作用，A-NK局部注射是行之有效的給藥途徑，并可減少IL-2全身應(yīng)用產(chǎn)生的巨大副作用。以LAK/IL-2為基礎(chǔ)的生物療法對(duì)實(shí)體瘤的治療效果很大程度上取決于LAK細(xì)胞在腫瘤部位的聚集能力。A-NK也不例外。A-NK細(xì)胞是外周血NK細(xì)胞的一小部分(4% ～30%)，由于具有高水平的增殖能力和細(xì)胞毒性以及獨(dú)特的功能特點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)日益受到研究人員的重視，如何獲得足量供常規(guī)治療用的高細(xì)胞毒活性的免疫效應(yīng)細(xì)胞是過(guò)繼免疫療法需要解決的重要問(wèn)題之一。

［1］王志華，等.腫瘤細(xì)胞因子治療.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2001，22(3):33-35.