馬志方 許召良 岳亮 郝振文 王東文

越來越多的證據(jù)表明腫瘤干細(xì)胞客觀存在，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[1-4]，這部分細(xì)胞只占全部腫瘤細(xì)胞很小的比例，但與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤對(duì)化療藥物耐受和放療不敏感都與腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。隨著對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)及腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究，人們發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞存在許多相似之處，這些細(xì)胞具有自我更新和分化的潛能，并且有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[5]。本研究探討采用熒光激活流式細(xì)胞分選前列腺癌細(xì)胞系，得到前列腺癌干祖（stem/progenitor,?S/P）細(xì)胞，并進(jìn)一步鑒定其表面標(biāo)志物的表達(dá)，以及細(xì)胞的生長和侵襲特性。

材料和方法

一、主要材料

RPMI1640培養(yǎng)基（美 國 Invitrogen公司）；10﹪胎牛血清（美國Gibco公司）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和SYBR等定量PCR所需要試劑（美國BIO-RAD公司）；CD133、α2β1整合素、CK8、CD44、PSA、AR 和β-actin等定量RT-PCR引物（上海生工生物工程公司）；流式細(xì)胞分選儀（美國BD公司）；熒光顯微鏡及數(shù)字圖像攝影系統(tǒng)（日本Olympus公司）；LNCaP細(xì)胞株（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；CD133/2?(293C3)-PE 鼠抗人單克隆抗體（美國Miltenyi公司），CD44-FITC鼠抗人單克隆抗體（美國BD公司）；CD133兔抗人一抗、CK8雞抗人多克隆一抗（美國Abcam公司）；CD44鼠抗人多克隆一抗（美國eBioscience公司）；AR(C-19)兔抗人多克隆一抗、Integrin β1 (N-20)、GADPH?(6c5)鼠抗人單克隆抗體和PSA?(A67B/E3)鼠抗人單克隆抗體（美國 Santa?Cruz公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和熒光激活細(xì)胞分選(florescence-activated cell sorting, FACS)：將 細(xì)胞培養(yǎng)于含10﹪胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、含5﹪?CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天更換1次培養(yǎng)液；待細(xì)胞培養(yǎng)至85﹪融合時(shí)，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)24?h；選擇狀態(tài)良好、95﹪融合且位于指數(shù)生長期的細(xì)胞備用。0.5﹪Trypsin-EDTA消化，磷酸鹽緩沖 液 (phosphate?buffer?saline,?PBS) 漂 洗并 離心后重懸于 PBS 中，細(xì)胞計(jì)數(shù)約 1×106個(gè) /ml，用CD133-PE和CD44-FITC鼠抗人單克隆抗體標(biāo)記，置于4℃孵育20?min；PBS洗2次后以流式細(xì)胞儀檢測和分選，流式檢測均重復(fù)3次。分選后的S/P細(xì)胞培養(yǎng)于無血清，加有數(shù)種生長因子的RPMI1640條件培養(yǎng)液。

2.定量RT-PCR檢測S/P細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)：PCR引物設(shè)計(jì)如下：α2β1整合素上游5'-GTCGGGGGCTTCAACTTAGAC-3'；下游 5'-CCTGGCTGGCTGGTATTAGC-3'；CD133上游5'-AGCCTTCATCCACAGATGCT-3'；下游 5'-GTG?CATTTCTCCACATTT-3'；CK8 上游5'-TGGAGTCTCGCCTGGAAG-3'；下游5'-CCTCGTACTGTGCCTTGAC-3'；CD44 上游5'-TTTGCATTGCAGTCAACAGTC-3'；下游5'-GTTACACCCCAATCTTCATGTCCAC-3'；PSA 上游 5'-GGTGACCAAGTTCATGCTGTG-3'；下游 5'-GTGTCCTTGATCCACTTCCG-3'；AR上游5'-TAGCCCCCTACGGCTACA-3'；下游5'-TTCCGAAGACGACAAGATGGAC-3'；β-actin上游 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'；下游 5'-CTCCTTAATGTCACGCAGAT-3'；每個(gè)樣品加樣重復(fù)3孔。實(shí)驗(yàn)分3組，分別為傳代培養(yǎng)組、非S/P組和S/P組。Trizol提取培養(yǎng)細(xì)胞的總 RNA，定量后取 2 μg（10 μl），加 Oligo dT 1 μl，DNTP(10 mmol/L) 1 μl，DDW(DEPC) 2 μl，總 反應(yīng)體系14 μl，在PCR儀上行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。條件為先 65℃?5?min，然后加 superscript?Ⅲ酶 1 μl，緩沖液 4 μl，DTT (0.1 mol/L) 1 μl，反應(yīng)體系 20 μl，42℃?50?min,70℃?15?min。反應(yīng)結(jié)束后加 180 μl雙蒸水稀釋，-20℃保存,使用時(shí)再稀釋10倍。定量PCR反應(yīng)體系10μl，包 括 cDNA 4 μl，5?MM primer mixture 1 μl，SYBR-490 5μl，采用2步法，反應(yīng)條件為第一步95℃?2?min,一個(gè)循環(huán)；第二步 95℃?10?s,?55℃?30?s，40 個(gè)循環(huán)。

3.Western?blot檢測S/P細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)：分為傳代培養(yǎng)組、非S/P組和S/P組。培養(yǎng)的細(xì)胞用適量PBS洗1次，吸凈，加適量RIPA裂解液，含蛋白酶抑制劑，冰上放置30?min，將裂解液轉(zhuǎn)移至 EP 管，4℃ 14000?×g離心 10?min，將上清液轉(zhuǎn)至新的EP管（蛋白液），測定濃度。配制SDS/PAGE凝膠，取30 μg蛋白加適量緩沖液上樣，電泳 50?V?30?min，接著 100?V?1.5～?2.0?h。根據(jù)膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應(yīng)略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1?min，再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。在一淺盤中打開轉(zhuǎn)移盒，將一個(gè)預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸泡過的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的濾紙，小心地將膠板放在濾紙上，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時(shí)注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕過的3?mm濾紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的白色端，填滿轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時(shí)防止出現(xiàn)氣泡。連接電源,在4℃條件下維持恒壓100?V，1h。將膜移出至封閉液（5﹪牛奶PBST）封閉至少1?h。加入適量封閉緩沖溶液稀釋的一抗（1:500～?1:1000），室溫輕輕搖動(dòng) 2?h 以上。從容器中倒出一抗封閉緩沖溶液，用PBET緩沖溶液清洗3次，每次10?min。接著加入適量封閉緩沖溶液及稀釋的二抗（1:5000），室溫輕輕搖動(dòng)60?min，倒出二抗及封閉緩沖溶液，用PBST緩沖溶液清洗3次，每次10?min。倒掉PBST緩沖溶液，并加入顯影劑，在圖像分析儀下采集圖像并分析。

4.免疫熒光法檢測S/P細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)：將培養(yǎng)的細(xì)胞克隆用冰甲醇置于冰上固定15?min，PBS 輕柔沖洗 3 次，每次 10?min，室溫下5﹪牛血清白蛋白PBS封閉液封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)30?min，吸掉封閉液，滴加封閉液稀釋的一抗（稀釋比 1:500～?1:100）室溫下孵育 2?h，PBS 漂洗3次，每次10?min，滴加適量封閉液稀釋的二抗室溫下避光孵育60?min。吸掉液體，適當(dāng)干燥，用含有 DAPI的封片液封片，在?Olympus?IX70?熒光顯微鏡下觀察拍照。

5.球體形成實(shí)驗(yàn)檢測S/P細(xì)胞自我更新能力：分為傳代培養(yǎng)組、非S/P組和S/P組。單個(gè)細(xì)胞懸液 (1×103, 懸于 50 μl培養(yǎng)液 ) 與?Matrigel?50 μl混勻（用前置于冰上），100?μl混合液沿著 24孔低黏附培養(yǎng)板（美國BD公司）邊沿緩緩加入。每種細(xì)胞重復(fù)3孔。培養(yǎng)板置于37?℃培養(yǎng)箱中10?min，然后加入 500?μl特殊培養(yǎng)液。特殊培養(yǎng)液為無血清的上皮基礎(chǔ)培養(yǎng)液，另加有ProstaLife?LifeFactors（德國 Lifeline?cell?technology）。每 3天換液1次，細(xì)胞培養(yǎng)14?d后在Olympus光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

6.軟瓊脂糖凝膠腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測S/P細(xì)胞成瘤性：配制0.8﹪的瓊脂糖凝膠(熔于RPMI-1640培養(yǎng)液),微波爐加熱至充分溶解，將凝膠鋪于6孔板，每孔2?ml。將非S/P組和S/P組消化，重懸。適當(dāng)溫度（37℃）的0.8﹪的瓊脂糖凝膠與預(yù)置的細(xì)胞懸液（3000個(gè)/3?ml）1:1體積混合成0.4﹪含細(xì)胞的瓊脂糖凝膠（6?ml，每種細(xì)胞每孔加2?ml，重復(fù)3孔），待下層凝膠冷卻凝固后，鋪于6孔板上層。待上層膠凝固后每孔再加入2?ml的含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液提供營養(yǎng)支持。每3?d換培養(yǎng)液。2周后用1?mg/ml碘硝基四唑紫(INT)對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行染色，37?℃培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù) >?2?mm 的克隆。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS?16.0?統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各標(biāo)志物定量PCR結(jié)果、球體形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果和腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果,CD133、CD44、AR、CK8、PSA等指標(biāo)用x±?s表示，組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)??果

一、細(xì)胞培養(yǎng)和FACS

CD133和CD44雙陽性的細(xì)胞數(shù)量為（1.1±0.3）﹪。用離心管收集分選的S/P細(xì)胞和非S/P細(xì)胞備用。流式分選的結(jié)果見圖1。的表達(dá)

圖1 ?人前列腺癌細(xì)胞熒光激活流式分選結(jié)果?

二、定量RT-PCR檢測S/P細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物

在原代細(xì)胞、非S/P細(xì)胞和S/P細(xì)胞中，用本方法檢測S/P細(xì)胞的主要標(biāo)志物CD133、CD44和α2β1整合素的mRNA表達(dá)，同時(shí)檢測分化成熟的腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物AR、CK8和PSA的mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖2所示，與非S/P細(xì)胞比較，S/P細(xì)胞中干祖細(xì)胞主要標(biāo)志物CD133、CD44和α2β1整合素的mRNA表達(dá)較非S/P細(xì)胞明顯增 高（t=17.376，3.859，8.611；P=0.000，0.021，0.001）；相反，S/P細(xì)胞中分化成熟的腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物AR、CK8和PSA的mRNA表達(dá)非常低 (t=3.518，11.372，3.845；P=0.029，0.000，0.018）。

圖2 定量RT-PCR檢測分選出的人前列腺癌S/P細(xì)胞中干祖細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的表達(dá)

三、Western?blot檢測S/P細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)

在原代細(xì)胞、非S/P細(xì)胞和S/P細(xì)胞中，用本方法檢測S/P細(xì)胞的主要標(biāo)志物CD133、CD44和α2β1整合素的蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測分化成熟的腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物AR、CK8和PSA的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，與非S/P細(xì)胞比較，S/P細(xì)胞中干祖細(xì)胞主要標(biāo)志物CD133、CD44和α2β1整合素的蛋白表達(dá)明顯增高；相反，S/P細(xì)胞中分化成熟的腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物AR、CK8和PSA的蛋白表達(dá)明顯降低。

圖3 Western?blot檢測分選出的人前列腺癌S/P細(xì)胞中干祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的表達(dá)

四、免疫熒光法檢測S/P細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)

在非S/P細(xì)胞和S/P細(xì)胞中，用本方法檢測S/P細(xì)胞的主要標(biāo)志物CD133和α2β1整合素的蛋白表達(dá)，同時(shí)檢測分化成熟的腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK8和AR的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，與非S/P細(xì)胞比較，S/P細(xì)胞中干祖細(xì)胞主要標(biāo)志物CD133和α2β1整合素的蛋白表達(dá)明顯增高；相反，S/P細(xì)胞中分化成熟的腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK8和AR的蛋白表達(dá)明顯降低。

圖4 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色情況（×400）

五、球體形成實(shí)驗(yàn)檢測S/P細(xì)胞自我更新能力

細(xì)胞培養(yǎng)14d后非S/P細(xì)胞和S/P細(xì)胞形成前列腺球的數(shù)量分別為（4.35±0.87）個(gè)和（35.12±4.56）個(gè) ,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t?=13.013，P?=0.000），說明分選出的 S/P 細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力。并且在顯微鏡下觀察（×100），S/P細(xì)胞形成的前列腺球體積較大，細(xì)胞數(shù)多（圖5）。

六、軟瓊脂糖凝膠腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測

圖5 光學(xué)顯微鏡下觀察人前列腺球體（×100）S/P細(xì)胞成瘤性

細(xì)胞培養(yǎng)2周后非S/P細(xì)胞和S/P細(xì)胞可以在軟瓊脂凝膠中克隆性生長，陽性克隆數(shù)分別為(18.34±1.21) 個(gè)克隆和 (82.27±7.54) 個(gè)克?。籗/P細(xì)胞與非S/P細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t?=8.617，P?=0.001，圖6）。腫瘤細(xì)胞體外克隆形成能力是反映腫瘤細(xì)胞惡性程度及其轉(zhuǎn)移潛能的重要指標(biāo)。軟瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)表明，S/P細(xì)胞克隆性生長和轉(zhuǎn)移潛能較非S/P細(xì)胞明顯增強(qiáng)。

討 論

圖6 ?軟瓊脂糖凝膠腫瘤克隆形成實(shí)驗(yàn)，觀察人前列腺細(xì)胞腫瘤克隆形成情況

細(xì)胞表面黏附分子CD133，是具有獨(dú)特的5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)大的N-糖基化細(xì)胞外環(huán)的跨膜糖蛋白，其表達(dá)的一個(gè)顯著特點(diǎn)就是隨著細(xì)胞的分化迅速下調(diào),這使得它成為一個(gè)分離和鑒定干細(xì)胞和祖細(xì)胞的獨(dú)特分子標(biāo)志物。CD44也是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，屬于黏附分子類，其分布十分廣泛，主要參與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的特異性粘連過程，且在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。目前CD44作為多種已知腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物，也逐漸受到人們的進(jìn)一步關(guān)注。在前列腺癌組織中已經(jīng)證實(shí)可以分選出干細(xì)胞樣的腫瘤細(xì)胞。Collins等[6]較早報(bào)道在不同分級(jí)分期的前列腺癌患者腫瘤組織中均分選出表型為 CD44+/α2β1integrinhi/CD133+的干細(xì)胞樣細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的0.1﹪，具有自我更新、增殖和分化的潛能，并且成瘤性和侵襲能力較強(qiáng)，這些細(xì)胞與真正的干細(xì)胞還有差異，一般稱之為S/P細(xì)胞。Guzmán-Ramírez等[7]從前列腺癌患者腫瘤中取出的上皮部分進(jìn)行三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)有前列腺球體形成，并且可以傳代，說明部分細(xì)胞具有自我更新的能力；檢測細(xì)胞分子標(biāo)志物，形成球體的細(xì)胞具有上皮基層細(xì)胞的特點(diǎn) CK5+/CK14+/CK19high/CK18-?/low/?c-met+/AR-/low/PSA-/low，同時(shí)具有正常干細(xì)胞的標(biāo)志CD49b+/CD49f+/CD44+/ΔNp63+/Nestin+/CD133+，進(jìn)一步明確了前列腺癌腫瘤組織含有少量干細(xì)胞特點(diǎn)的細(xì)胞。另外研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞中CD44+CD24-的亞群具有干細(xì)胞的部分特性，侵襲性和成瘤性明顯增強(qiáng)[8]。但是這些細(xì)胞在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中具體發(fā)揮怎樣的作用，其機(jī)制如何還有待深入研究。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代較為困難，為了進(jìn)一步研究前列腺癌S/P細(xì)胞的作用和相關(guān)調(diào)控機(jī)制，不少學(xué)者嘗試在前列腺癌細(xì)胞系中分選S/P細(xì)胞。常用的分選方法有免疫磁珠法和熒光激活流式細(xì)胞分選[9-10]，課題組采用2種方法都可以成功地分選出S/P細(xì)胞，相對(duì)于前者，后者可以同時(shí)多抗體標(biāo)記腫瘤細(xì)胞。課題組發(fā)現(xiàn)，相比采用CD133、CD44和α2β1整合素3種抗體標(biāo)記或者采用其中單一抗體標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，采用CD133和CD44雙抗體標(biāo)記腫瘤細(xì)胞可以得到合適的一定數(shù)量S/P細(xì)胞，有利于進(jìn)一步的功能和機(jī)制研究。同時(shí)，課題組不僅在LNCaP細(xì)胞，而且在PC3、C4-2等細(xì)胞系中采用同樣的方法都可以分選出S/P細(xì)胞，具有S/P細(xì)胞的分子標(biāo)志物，與非S/P細(xì)胞比較，S/P細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力和成瘤性。

S/P細(xì)胞的特點(diǎn)是具有特殊的分子標(biāo)志物，有分化潛能，并有較強(qiáng)的自我更新能力和成瘤性，一般認(rèn)為細(xì)胞球體形成實(shí)驗(yàn)和瓊脂糖凝膠細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)可以反映上述能力。課題組采用不同的方法，在RNA和蛋白等不同水平檢測了分選出S/P細(xì)胞的標(biāo)志物，結(jié)果證實(shí)這部分細(xì)胞確實(shí)為S/P細(xì)胞；并且同時(shí)檢測了分化成熟的腺上皮細(xì)胞標(biāo)志物，在S/P細(xì)胞中，這些細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)明顯較低，表明分選出的細(xì)胞還沒有分化成熟，可能有分化潛能。課題組研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在不同細(xì)胞系中S/P細(xì)胞的比例不同，PC3細(xì)胞中的S/P細(xì)胞遠(yuǎn)多于LNCaP細(xì)胞，這與PC3細(xì)胞的來源和生物學(xué)特性相一致，即PC3具有更強(qiáng)的生長和侵襲能力。

本研究成功地從多種人前列腺癌細(xì)胞系中分選出S/P細(xì)胞并鑒定，為進(jìn)一步研究S/P細(xì)胞在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用和機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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