李占全 趙勇 付晶京

心肌梗死是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，修補梗死的心肌是治療心肌梗死的關(guān)鍵。實驗表明，體內(nèi)的多種干細(xì)胞具有分化成心肌細(xì)胞的能力[1]。注射分化的心肌細(xì)胞可以到達(dá)心肌梗死處，形成新的心肌并恢復(fù)心臟的功能[2]。找到一種能有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的方法將有助于治療心肌梗死。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal?stem?cell,?MSC)是一種多能干細(xì)胞，具有分化成心肌細(xì)胞的能力。研究表明卵泡抑素（follistatin,?FS）、骨形成蛋白?(bone?morphogenetic?protein,?BMP) 和?Wnt11均在心肌細(xì)胞的發(fā)育過程中表達(dá)并在心肌細(xì)胞形成的不同階段起重要作用[3-5]。本研究探討了協(xié)同利用FS、BMP6和Wnt11對人骨髓?MSC向心肌細(xì)胞分化的影響并首次證明協(xié)同利用三者可使人MSC出現(xiàn)類似于心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及基因表達(dá)的變化。

材料和方法

一、材料和試劑

DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，卵泡抑素、骨形成蛋白和Wnt11（美國R&D?Systems公司），F(xiàn)icoll分離液、D–hank液、青霉素和鏈霉素均為美國Sigma公司產(chǎn)品。

二、方法

1.?MSC 的分離：(1) 用含肝素的 D-hank?液與抽取的健康人骨髓血 1:1?等量混勻，1000?×g離心10?min，棄上清；(2)沉淀與含肝素的D-hank 液混勻，緩緩加入 Ficoll上層，1730?×g離心30?min；(3)棄上清，抽取MSC至離心管中，PBS離心，沖洗2次；(4)沉淀加入DMEM完全培養(yǎng)液 (10﹪ 胎牛血清），按 2?×?105個 /cm2密度接種于培養(yǎng)瓶，37℃、5﹪?CO2培養(yǎng)箱全濕條件下培養(yǎng)。

2.?MSC的傳代培養(yǎng)：原代細(xì)胞生長到80﹪融合時，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，取37℃預(yù)熱過的 0.25﹪ 胰酶 2?ml，37℃消化 2?min。DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全從培養(yǎng)瓶中脫落并吹打成單細(xì)胞懸液。吸取細(xì)胞懸液至?15?ml的離心管中，1500?×g離心?5?min，移去上清。PBS洗滌2次，加入DMEM培養(yǎng)液。1:2比例傳代培養(yǎng)。2代細(xì)胞用于誘導(dǎo)實驗。

3.?MSC的鑒定：用流式細(xì)胞儀檢測CD34?APC、CD45?FITC、CD90?PE 和 CD105PE 的表達(dá)。

4.?MSC 的誘導(dǎo)：2 代 MSC 細(xì)胞，按 1?×?104個/cm2接種于含DMEM完全培養(yǎng)液的6孔板中。2?d后，換用含10﹪FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液并分別在第1天，第8天和第16天，加入FS、BMP和Wnt11。

5.細(xì)胞RNA的提取及RT-PCR檢測：Trizol試劑1?ml加入到6孔板中，提取總RNA。應(yīng)用Invitrogen的RT-PCR檢測試劑盒進行RT-PCR的檢測。PCR 產(chǎn)物；(1)?Nkx2.5，擴增長度 525?bp，正引物為 5'-AGCCCTGGCTACAGCTGCA-?3'，反引物為 5'-?TGGGAGCCCCTTCTCCCCA-3'；(2)?MEF2c，擴增長度 233?bp，正引物為 5'-?GA?CTTTCTGAAGGATGGGCAA-3'，反引物為5'-?CAAGTGCTAAGCTTATCTCAGCA?-3'；(3)?GAPDH，擴增長度 139?bp，正引物為 5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，反引物為 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAGC-3′。

結(jié)??果

一、FS、BMP6和Wnt11對人骨髓MSC形態(tài)變化的影響

人骨髓MSC在原代培養(yǎng)基中正常生長，20?d左右，細(xì)胞達(dá)到90﹪融合。傳代后的?MSC多數(shù)為成纖維樣的梭形細(xì)胞(圖1a)。流式細(xì)胞儀檢測表明細(xì)胞?CD90 和?CD105 陽性而 CD34?和?CD45?陰性。FS、BMP6和Wnt11處理后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)了明顯的變化(圖1b～?h)。特別是 BMP6處理后的第4天，細(xì)胞形態(tài)變粗(圖1e)。Wnt11處理后，出現(xiàn)了許多柱形細(xì)胞(圖1h)，相互交織，這與?Makino等[1]利用5-Aza誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞非常相似。未處理細(xì)胞一直是梭形。

圖1 FS、BMP6和Wnt11處理前后人骨髓?MSC?的形態(tài)變化

二、FS、BMP6和Wnt11對人骨髓MSC表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物的影響

RT-PCR檢測顯示FS、BMP6和Wnt11處理后的人骨髓?MSC表達(dá)心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物?NKx2.5和MEF2c。未處理細(xì)胞沒有表達(dá)上述心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物(圖2)。

圖2 FS、BMP6和Wnt11誘導(dǎo)人骨髓MSC表達(dá)心肌性細(xì)胞特異性基因電泳圖

討 論

Makino等[1]1999年首次報道了利用5-Aza可以誘導(dǎo)骨髓MSC分化成心肌細(xì)胞。一般認(rèn)為5-Aza是通過影響B(tài)MP信號系統(tǒng)的活性誘導(dǎo)MSC向心肌細(xì)胞分化[6]。由于5-Aza的毒性作用及誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞可產(chǎn)生免疫排斥和腫瘤的后果，故5-Aza所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞無臨床應(yīng)用價值。

BMPs是心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞形成中必不可少的調(diào)節(jié)因子[7]。BMP通過調(diào)節(jié)心臟重要的轉(zhuǎn)錄因子NKx2.5和MEF2c等的表達(dá)參與心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞形成。Zhao等[3,8]報道FS通過調(diào)節(jié)BMP的作用影響心肌細(xì)胞形成，過量或缺乏FS均引起心臟發(fā)育異常。Genovese等[9]報道電刺激MSC分化成心肌細(xì)胞的同時，F(xiàn)S的表達(dá)也增加。電刺激使FS表達(dá)增加再誘導(dǎo)MSC向心肌細(xì)胞分化還是心肌細(xì)胞分化的同時伴有FS的增加尚不清楚。Wnt11在正常心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞的形成過程中起重要作用[10-11]。剔除Wnt11的非洲爪蟾無心臟的形成。由于FS、BMP6和Wnt11在動物心臟及心肌細(xì)胞形成過程中的重要作用，本文探討了協(xié)同利用FS、BMP6和Wnt11對MSC向心肌細(xì)胞分化的影響。

結(jié)果表明協(xié)同利用三者使MSC出現(xiàn)類似于心肌樣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化即出現(xiàn)了許多柱形細(xì)胞(圖1h)及心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)(圖2)。特別是BMP加入后MSC的形態(tài)變粗(圖1e)，表明BMP對MSC的分化有重要影響。Wnt11加入后MSC出現(xiàn)了許多柱形細(xì)胞(圖f、g、h)，相互交織，這與?Makino等[1]利用?5-Aza誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞非常相似。表明Wnt11促進了MSC向心肌細(xì)胞的分化。同時，RT-PCR檢測顯示三者處理后的人骨髓MSC表達(dá)心肌細(xì)胞的特異性標(biāo)志物NKx2.5?和?MEF2c。二者是心臟重要的轉(zhuǎn)錄因子及心肌細(xì)胞特定的標(biāo)志物。這些標(biāo)志物的表達(dá)表明所誘導(dǎo)的細(xì)胞不僅在形態(tài)上發(fā)生了朝向心肌樣細(xì)胞的變化而且在基因表達(dá)層面也開始向心肌細(xì)胞方向分化。

Nurse等[12]認(rèn)為細(xì)胞的形態(tài)是細(xì)胞的特定標(biāo)志物之一。經(jīng)過FS、BMP6和Wnt11處理后，MSC出現(xiàn)了類似于心肌樣細(xì)胞的形態(tài)變化及心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物NKx2.5?和?MEF2c的表達(dá)，說明三者可以誘導(dǎo)MSC朝向心肌樣細(xì)胞分化。誘導(dǎo)的成熟心肌細(xì)胞除了應(yīng)有形態(tài)學(xué)變化及心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)外，細(xì)胞還應(yīng)該能跳動、類似于心肌細(xì)胞的動作電位、有心肌樣的超微結(jié)構(gòu)及肌鈣蛋白和心結(jié)蛋白的表達(dá)。目前，作者正進一步探討誘導(dǎo)能跳動的心肌細(xì)胞，以便為找到一種能有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的方法做出貢獻(xiàn)。

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