鄭二麗，楊曉泉*，吳娜娜

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，食物蛋白工程研究所，廣東 廣州 510640)

不同方法制備的大豆分離蛋白功能性質(zhì)的比較研究

鄭二麗，楊曉泉*，吳娜娜

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，食物蛋白工程研究所，廣東 廣州 510640)

采用普通的堿溶酸沉方法、Samoto法、鈣離子沉淀法制備出幾種大豆分離蛋白，并對(duì)其產(chǎn)率、總脂含量及溶解性、乳化性等物化性質(zhì)和功能性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)比較。結(jié)果表明：鈣離子沉淀法制備的大豆分離蛋白(Less-LP SPI)的產(chǎn)率是堿溶酸沉大豆分離蛋白(APP)產(chǎn)率的65%，但高于由Samoto法提取的7S與11S兩種大豆分離蛋白產(chǎn)率之和；Less-LP SPI的總脂含量比APP降低了45%，由Samoto法提取的親脂性蛋白(LP)中總脂含量達(dá)到7.48%，而7S與11S蛋白中脂含量分別為1.45%、2.36%。在功能性質(zhì)上，LP的溶解性、乳化活性均比較差，7S、11S質(zhì)量比1:2混合蛋白的溶解性最好，而Less-LP SPI在pH≤10時(shí)溶解性低于APP；乳化性方面，Less-LP SPI的乳化活性稍低于7S、11S質(zhì)量比1:2的混合蛋白及APP，但乳化穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于后者?？傮w上，Less-LP SPI脂含量少、乳化穩(wěn)定性好，方法簡(jiǎn)單，且可提高其貨架期。

大豆分離蛋白；溶解性；乳化性；總脂含量

大豆蛋白屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上可與動(dòng)物蛋白相匹配，是人類較為安全和經(jīng)濟(jì)的植物蛋白質(zhì)資源。按照沉降模式，可將大豆蛋白分為2S、7S、11S、15S 4種組分[1]。不少研究學(xué)者通過電泳分析7S與11S是大豆蛋白的主要成分，約占球蛋白的70%，是主要的貯存蛋白，而1987年Setsuko等[2]通過免疫印跡的方法指出7S、11S只占大豆蛋白的50%左右。Samoto等[3-4]在1998年及2006年分別從脫脂豆?jié){中提取出油體結(jié)合蛋白(OBAPs)及親脂性蛋白(LP)，他們指出大豆分離蛋白不僅包含β-伴球蛋白7S和球蛋白11S，還包含一部分LP，且LP在分離蛋白中的相對(duì)含量為31%。

OBAPs及LP是一組與磷脂等極性脂緊密結(jié)合的蛋白，是一種膜蛋白，有學(xué)者報(bào)道[5-7]大豆蛋白中豆腥味的產(chǎn)生主要是因?yàn)樵诿撝狗壑羞€存在一些極性脂，磷脂自動(dòng)氧化生成的一些小分子物質(zhì)正是影響大豆風(fēng)味的揮發(fā)性成分，因此與磷脂緊密結(jié)合的蛋白(LP)是豆腥味的來(lái)源之一。磷脂是兩性物質(zhì)，由于磷脂的存在，使得LP蛋白具有疏水親油性，影響了蛋白的一些功能性質(zhì)，如乳化性、溶解性、起泡性、凝膠性等。因此去除親脂性蛋白可以改善大豆蛋白風(fēng)味及某些功能性質(zhì)。

Samoto法主要采用熱處理和pH值回調(diào)，通過3步法分離去除LP蛋白，得到優(yōu)質(zhì)的7S及11S蛋白，此方法首先將大豆粉在70℃干熱處理2h有利于11S與LP的分離，從而可以提高11S的純度，將分離11S后的蛋白提取液在55℃條件下加熱15min后將pH值回調(diào)，這樣促進(jìn)了7S與LP的分離。這種方法比較繁瑣且費(fèi)時(shí)。

通過添加二價(jià)陽(yáng)離子，然后一步法除去LP，也可得到優(yōu)質(zhì)分離蛋白，這種方法比較簡(jiǎn)單。已有研究探討此方法得到的分離蛋白的風(fēng)味性，但功能性質(zhì)方面的研究還未見報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)主要是將由一步法得到的分離蛋白與普通的堿溶酸沉分離蛋白、7S與11S質(zhì)量比1:2的混合蛋白及LP蛋白在蛋白回收率、總脂含量及溶解性、乳化性等功能性質(zhì)上進(jìn)行對(duì)比，來(lái)表征一步法得到的大豆分離蛋白具有較好的乳化穩(wěn)定性，為提高此蛋白質(zhì)制得產(chǎn)品的貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

低溫脫脂豆粕(蛋白質(zhì)含量53.8%、水含量8.8%、脂含量5.6%、氮溶指數(shù)85.4%、鈣含量1.68mg/g豆粉)購(gòu)于山東禹王有限公司，將其于4℃保存以備用。

溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺、N,N-二甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TMED)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 上海博奧生物科技有限公司；氧化鑭 廣州市立拓有色金屬有限公司；疊氮鈉 上海葉舟生化科技有限公司；其余試劑均為分析純。

DYF-500搖擺式高壓萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；THZ-82水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇宏華儀器廠；DELTAT-24/LSC冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；ECP3000三恒電泳儀 北京市六一儀器廠；Rapid N Cube快速定氮儀 德國(guó)Elementrar公司；SevenEasy pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；CR22G高速冷凍離心機(jī)、Polarized Zieman原子吸收光譜儀、RF5301日立熒光光譜儀 日本Hitachi公司；UV2300紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；Mastersizer 2000粒度分布儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；APV均質(zhì)機(jī)丹麥APV公司。

1.2 方法

1.2.1 幾種大豆分離蛋白樣品的制備

普通酸沉分離蛋白(APP)的制備：低溫脫脂豆粕經(jīng)粉碎后，過60目篩，取40g以上處理所得的豆粉添加400mL水，用2mol/L NaOH調(diào)pH8.0，提取液于常溫條件下攪拌2h，然后15℃、4000×g離心10min，棄豆渣，上清液用2mol/L的HCl將pH值調(diào)至4.5，攪拌30min后，15℃、2000×g離心10min，沉淀即為酸沉大豆蛋白，用去離子水重新分散并調(diào)節(jié)pH值至7.5，經(jīng)過透析后進(jìn)行冷凍干燥，置于4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

鈣離子沉淀法提取大豆分離蛋白(Less-LP SPI)：將脫脂豆粉按質(zhì)量比1:10的比例加蒸餾水，用2mol/L NaOH調(diào)分散液的pH值至7.0，常溫?cái)嚢?h后加10mmol/L CaCl2溶液，置于50℃水浴鍋里加熱1h，冷卻后調(diào)pH值至起始值，再攪拌30min，然后15℃、4000×g離心10min，棄豆渣，其后步驟同上酸沉蛋白的制備方法。所得蛋白為親脂性蛋白比較少的分離蛋白，即Less-LP SPI。

7S、11S、LP 3種組分的制備是根據(jù)Samoto等[4]的方法稍加改進(jìn)，具體步驟如下：將脫脂豆粉在70℃條件下干熱2h，而后按1:10 的比例加蒸餾水，調(diào)分散液的pH值至8.0，常溫?cái)嚢?h，離心棄豆渣，將上清液調(diào)pH值至6.5，離心所得沉淀即為11S，調(diào)上清液pH值至5.0，55℃水浴15min，回調(diào)pH值至5.5，加50mmol/L的NaCl，離心得沉淀為L(zhǎng)P組分，所得上清液用2mol/L的HCl調(diào)pH值至4.5，離心得組分為7S，將以上所得各組分用離子水重新分散并調(diào)節(jié)pH值至7.5，經(jīng)過透析后進(jìn)行冷凍干燥，置于4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

7S與11S的混合液按其蛋白質(zhì)量比1:2的比例稱取，然后溶解進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定，其中在溶解度測(cè)定時(shí)以去離子水為溶劑，在乳化性測(cè)定時(shí)以磷酸緩沖液作為溶劑。

1.2.2 樣品產(chǎn)率、蛋白質(zhì)含量和回收率的測(cè)定

取適量樣品于130℃條件下干燥3h[8]，測(cè)定水分含量。采用Jung等[9]方法測(cè)定各蛋白組分的含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

根據(jù)所得各蛋白組分的蛋白質(zhì)含量、脫脂豆粉的質(zhì)量和總蛋白質(zhì)含量，可得各組分的蛋白質(zhì)回收率，公式如式(3)：

1.2.3 極性脂的測(cè)定

參考國(guó)標(biāo)GB 2906—1982《谷物、油料作物種子粗脂肪測(cè)定方法》，采用索氏抽提法測(cè)定各組分的極性脂含量，以氯仿-甲醇體積比2:1為抽提劑。極性脂含量計(jì)算公式如式(4)：

1.2.4 鈣含量的測(cè)定

鈣元素的含量測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.92－2003《食品中鈣的測(cè)定》進(jìn)行。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，所有玻璃儀器在使用前用硝酸-水體積比1:2的混合液清洗，其后用硝酸-水體積比1:10的混合液浸泡過夜備用。精確稱取0.250g樣品，溶于8mL混合液(水-H2O2-硝酸體積比1:1:2)中后消化2h，待消化管中混合液透明，趕氣3h至白煙完全消失。使用火焰原子吸收光譜儀，按照以下條件進(jìn)行元素分析：光源為空心陰極燈，波長(zhǎng)為422.7nm，狹縫寬為0.7nm，火焰燃?xì)鉃橐胰?。向待測(cè)樣品中加入0.5%氧化鑭以去除PO43-的干擾作用。以CaCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用該曲線求得樣品中鈣元素的含量，鈣元素的含量以每克蛋白里含有多少毫克鈣表示。

1.2.5 SDS-PAGE

根據(jù) Laemmli[10]的方法進(jìn)行SDS-PAGE分析，濃縮膠和分離膠分別為12.5%和3%，考馬斯亮藍(lán)R250染色。參照Mujoo等[11]的方法辨別11S、7S及LP各亞基，11S、7S及LP組分的純度為各自亞基的密度之和與它們3個(gè)總密度的比值。

1.2.6 溶解度測(cè)定

采用Lowry法[12]于500nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度的方法測(cè)定樣品溶解性：將蛋白樣品溶于去離子水使其質(zhì)量濃度為10mg/mL。用2mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)pH值至3～11，室溫條件下攪拌1h(在15、3、60min調(diào)節(jié)pH值)。取適量溶液于50mL離心管，20℃、10000×g離心10min后取上清液，采用福林酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度表示為上清液蛋白質(zhì)量濃度占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比。

1.2.7 乳狀液的制備及其粒度分布、平均粒徑大小的測(cè)定

將樣品用pH值7.0的磷酸鹽緩沖液配成質(zhì)量濃度為5mg/mL的溶液，將溶液與玉米油按質(zhì)量比9:1混合，采用APV均質(zhì)機(jī)20MPa均質(zhì)成乳狀液[13]。乳狀液樣品按質(zhì)量比1:1 0 0 0用去離子水稀釋，采用粒度分布儀Mastersizer 2000測(cè)定乳狀液中粒子大小及分布。玉米油及水的折射率分別為1.414和1.330。按式(5)分別計(jì)算表面積平均粒徑(d32)及體積平均粒徑(d43)。

式中：ni為直徑；di為脂肪球的數(shù)量。

1.2.8 乳狀液貯存穩(wěn)定性的測(cè)定

取5mL新制備的乳狀液于10mL帶有刻度及塞子的試管中，然后加幾滴0.5%的疊氮鈉，密封試管防止乳狀液揮發(fā)。將乳狀液于常溫條件下放置31d，貯存中乳析程度用乳析率(CI，%)表示。

式中：hs為乳漿層的高度/mm；hE為整個(gè)乳狀液的高度/mm。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。通過方差分析(ANOVA)和線性回歸模式(GLM)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以5%最小置信度(LSD)進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，并使用SAS系統(tǒng)進(jìn)行均值比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法制備的大豆分離蛋白樣品的組成及分析

表1 不同方法制備的蛋白樣品的產(chǎn)率、回收率及其組成和含量Table 1 Extraction yield, protein recovery and composition of 4 different SPIs

由表1可知，Less-LP SPI的蛋白回收率約為APP蛋白回收率的2/3，同時(shí)總脂含量也降低了45%，這表明降低的蛋白組分可能是與脂緊密結(jié)合的組分，Samoto等[4]稱這種與脂緊密結(jié)合的組分為L(zhǎng)P組分，這種組分的存在無(wú)疑影響著蛋白質(zhì)的風(fēng)味及一些功能性質(zhì)，因此LP的去除可以在一定程度上改善蛋白的風(fēng)味及特性；另外與APP相比，Less-LP SPI中蛋白含量增加，表明蛋白純度提高，但其中Ca元素比APP中多了1mg/g蛋白，這主要是因?yàn)樵谟肅aCl2作為沉淀劑時(shí)，會(huì)有少量的Ca2+與7S、11S蛋白的某些亞基共價(jià)結(jié)合，而形成可溶性的聚集體殘留在提取的蛋白中。

由Samoto方法提取的7S、11S、LP 3種組分的蛋白回收率比為：1:1.82:1.59，且11S與7S的蛋白含量都在90%以上，而LP蛋白含量?jī)H為85%左右，但其總脂含量達(dá)到了7.5%左右，與Samoto等[4]的研究結(jié)果一致。且7S蛋白得率與11S蛋白得率之和(19.18%)小于Less-LP SPI產(chǎn)品的得率(24.60%)，但脂的含量變化不大，這說(shuō)明由Samoto提取的優(yōu)質(zhì)蛋白得率較少。

2.2 SDS-PAGE電泳

圖1 不同方法提取所得大豆分離蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of 4 different SPIs

樣品 7S 11S LP Less-LP SPI 37.71±0.17b 55.02±0.92b 7.86±0.52c APP 34.34±0.83b 50.57±1.36c 15.09±0.47b 7S 72.45±1.57a 23.98±0.86d 3.57±0.15d 11S 24.68±0.37c 66.25±1.27a 9.30±0.27c LP 28.70±0.81c 48.26±0.64c 23.04±0.39a

由圖1可知，APP中含有較多的P34、Lx及P24亞基，通過Quantity one軟件分析(表2)，APP樣品中7S、11S、LP 3種組分的相對(duì)含量分別為：34.34%、50.57%、15.09%，相對(duì)來(lái)說(shuō)，Less-LP SPI樣品中7S、11S成比例的增加，分別為37.71%、55.02%，而其LP組分相對(duì)含量?jī)H為APP中LP相對(duì)含量的52%，結(jié)合表1中產(chǎn)率的變化，可進(jìn)一步表明造成Less-LP SPI產(chǎn)率減少的蛋白組分很大部分是LP。由Samoto法提取的7S、11S的蛋白含量都在90%以上，可看出這兩種蛋白樣品中LP的相對(duì)含量較少，而LP蛋白樣品中LP組分的含量達(dá)到了23.04%。

2.3 溶解度

圖2 不同分離蛋白的溶解度曲線Fig.2 Solubility of 4 different SPIs

由圖2可知，4種不同的分離蛋白在等電點(diǎn)附近溶解度都較低，偏離等電點(diǎn)溶解度開始增加，且7S、11S質(zhì)量比1:2混合蛋白的溶解度最高，而LP的溶解度相比較低(≤60%)，這主要是因?yàn)長(zhǎng)P中含有較多的與蛋白緊密結(jié)合的磷脂等極性脂的存在，使得其在水中大多以乳狀液的形式存在，這與Samoto等[4]證實(shí)的LP溶解性最差的結(jié)果一致；Less-LP SPI的溶解度低于APP(尤其在pH7～8時(shí))，原因可能是由于Less-LP SPI中含有較多的鈣(比APP多1.03mg/g pro)影響了蛋白的溶解度，Scilingo等[14]研究表明每克蛋白添加1.23～5mg Ca會(huì)造成7S的α與α′亞基以Ca2+為橋梁形成可溶性聚集，使得其溶解度降低。但在較高的pH值下，Less-LP SPI的溶解度要高于APP的溶解度，這可能是因?yàn)楦叩膒H值影響了Ca2+與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

2.4 乳化性

樣品的乳化特性用表面積平均粒徑d32與體積平均粒徑d43來(lái)表征，d32的大小可反應(yīng)乳狀液的乳化活性，d32越小，乳化活性越好，d43用來(lái)表征粒徑的變化，進(jìn)而反應(yīng)乳化穩(wěn)定性。2.4.1 乳化活性

圖3 4種樣品乳狀液表面積平均粒徑的大小Fig.3 Average diameter of the particles on the surface of fresh emulsion formed by 4 different SPIs

由圖3可知，4種分離蛋白的d32大小依次為：APP＜m7S:m11S＝1:2混合蛋白＜Less-LP SPI＜LP，表明APP的乳化活性高于Less-LP SPI的乳化活性，這與其溶解度及表面疏水性(h0(APP)＝1432.2＞h0(Less-LPSPI)＝964.0)變化是一致的，這主要是因?yàn)長(zhǎng)ess-LP SPI中含有少量Ca2+的存在(對(duì)比APP)，Ca2+的存在使得蛋白質(zhì)表面電荷減少，導(dǎo)致其降低油水界面表面張力的能力下降，造成油滴之間相互作用，形成大的表面積粒徑；A PP與7S、11S質(zhì)量比1:2混合蛋白的乳化活性無(wú)顯著性差異(P≥0.05)；LP的乳化活性最差。曲家妮等[15]也證明LP的乳化活性很低。原因一方面可能是因?yàn)長(zhǎng)P蛋白的溶解性太差，影響蛋白分子迅速遷移吸附到油滴表面，另一方面，LP的表面疏水性低，也很難吸附到油滴表面，而油滴表面高的蛋白濃度是形成小粒徑顆粒的重要因素[16]，從而使油滴粒徑增大，乳化活性有所降低。

2.4.2 乳化穩(wěn)定性

圖4 貯存第1天及第31天4種樣品乳狀液d43的變化(A)及第31天時(shí)乳狀液的乳析率(B)Fig.4 Change in particle sizes of emulsion formed by 4 different SPIs during storage for 1 days and 31 days and the creaming index of emulsion on the 31st day

為了分析4種分離蛋白所形成乳狀液的乳化穩(wěn)定性，將乳狀液在常溫條件下放置31d后測(cè)定其d43及乳析率的變化，結(jié)果如圖4所示。對(duì)比4種分離蛋白所制乳狀液在第1天時(shí)d43的大小，這與d32一致，即LP所制乳液的d43最大，其次為L(zhǎng)ess-LP SPI，而APP與m7S:m11S＝1:2混合蛋白所形成乳狀液的d43無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；APP及7S、11S質(zhì)量比1:2混合蛋白所形成乳狀液在31d后d43發(fā)生了明顯的變化，但由Less-LP SPI所形成的乳狀液的d43變化不大，B圖中由Less-LP SPI制備的乳狀液乳析率的變化最小，這些結(jié)果均表明Less-LP SPI具有良好的乳化穩(wěn)定性。

圖5 常溫條件下貯存第1天及第31天Less-LP SPI(A)及APP(B)乳狀液的粒徑體積分布變化圖Fig.5 Change in droplet size distribution of emulsion formed by Less-LP SPI (A) and APP (B)

由圖5可知，經(jīng)過31d常溫貯存的Less-LP SPI所制乳狀液的粒徑分布稍向大粒徑偏移(圖5A)，但偏移不大，而由APP形成的乳狀液中粒徑分布明顯向大粒徑偏移(圖5B)，且后面的小峰轉(zhuǎn)化為大峰，可能在貯存中乳狀液很不穩(wěn)定發(fā)生了聚集，但這需要電子顯微鏡觀察進(jìn)一步認(rèn)證。

3 結(jié) 論

3.1 以CaCl2為沉淀劑所提的分離蛋白(Less-LP SPI)蛋白回收率比APP降低了1/3，但樣品的純度提高，同時(shí)脂的含量減少了大約1.71%，通過SDS-PAGE分析所降低的蛋白組分可能是LP蛋白組分；由Samoto法提取的7S、11S蛋白含量在90%以上，且蛋白純度高，脂含量低，而LP樣品的蛋白含量為85.08%，脂的含量達(dá)到了7.48%。

3.2 由于Ca2+的作用，Less-LP SPI樣品在中性條件下表面疏水性及在pH＜10時(shí)溶解性均低于APP，7S、11S質(zhì)量比1:2混合蛋白具有更好的溶解性，LP樣品的溶解性最差，在高pH值下小于60%。從乳化性分析可看出，雖然Less-LP SPI樣品乳化活性小于APP及7S、11S質(zhì)量比1:2混合蛋白，但它具有較好的乳化穩(wěn)定性，用此蛋白做產(chǎn)品可提高樣品的貨架期。

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Comparison of Functional Properties of Soybean Protein Isolates Prepared by Different Methods

ZHENG Er-li，YANG Xiao-quan*，WU Na-na
(Research and Development Center of Food Proteins, College of Light Industry and Food,South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Several soybean protein isolates (SPI) were prepared by acid precipitation, Samoto method and calcium-precipitation method, respectively. The characteristics including protein yield, total lipid content, solubility and emulsification of these SPIs were investigated. Our results showed that the yield of calcium-precipitation protein (Less-LP SPI) was lower than that of acid precipitation protein (APP), but higher than 7S, 11S extracted by Samoto fractionation procedure. The lipid content of Less-LP SPI was decreased by 45% when compared with that of APP. The lipid content of lipophilic protein (LP) obtained from Samoto fractionation was 7.48%, but the lipid contents in 7S and 11S were 1.45% and 2.36%, respectively. The Samoto LP-rich fraction had inferior solubility and emulsifying properties. Less-LP SPI had lower solubility (pH ≤ 10) and emulsifying activity than APP, while Less-LP SPI had superior emulsion stability. In summary, Less-LP SPI has lower lipid and better emulsion stability and therefore can improve the shelf life of foods.

soy protein isolate；solubility；emulsification；lipid content

TS201.21

A

1002-6630(2012)15-0107-06

2011-07-06

廣東省重大科技專項(xiàng)(2009A080209001)

鄭二麗(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食、油脂與植物蛋白工程。E-mail：erli1225@163.com

*通信作者：楊曉泉(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榇蠖沟鞍椎拈_發(fā)利用。E-mail：fexqyang@163.com