林利美，陳季旺，吳永寧，宮智勇,*

(1.武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100021)

草魚肽的體外生理功能

林利美1，陳季旺1，吳永寧2，宮智勇1,*

(1.武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100021)

以草魚為原料制取生理活性肽，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制活性，采用DPPH自由基清除法、氧自由基清除能力(ORAC) 法研究其抗氧化性。結(jié)果表明：草魚肽抑制ACE活性IC50為0.229mg/mL，清除DPPH自由基的IC50為7.630mg/mL，ORAC值為1317.962μmol Trolox/g，采用草魚制備有效的生理活性肽是可行的。

草魚肽；ACE抑制活性；DPPH自由基；ORAC

生物活性肽是指能夠調(diào)節(jié)生物機(jī)體的生命活動(dòng)或有特殊生理作用的肽類，具有涉及神經(jīng)、激素和免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、抗膽固醇、抗氧化、改善氮素吸收關(guān)系和礦質(zhì)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)食品風(fēng)味、硬度等多重功效[1-2]，因而在功能食品中具有重要的作用。

近年來，通過酶解魚類蛋白制取活性肽已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。草魚是我國產(chǎn)量最高的淡水魚。但因其肉質(zhì)水分含量高、魚體內(nèi)組織酶活躍、易腐敗、固有的土腥味等，受到我國現(xiàn)有的貯藏以及加工條件的限制，每年造成的腐敗損失率在30%以上，加工率不到10%[3]。因此，以淡水魚作為原料制取活性肽對(duì)我國漁業(yè)的深加工具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究草魚肽體外對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制作用，并用兩種方法評(píng)價(jià)其抗氧化性，為草魚肽保健食品的開發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 市售。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、馬尿酸(Hip)、熒光素(FL)、水溶性VE(Trolox)、2,2,-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽(AAPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1525-2998 高效液相色譜儀 美國Waters 公司；SpectraMaxM2e 熒光酶標(biāo)儀 美國分子儀器公司；7200可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；LG-3型冷凍干燥機(jī) 寧波市生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 草魚肽的制備

參照文獻(xiàn)[4]，具體工藝流程為：草魚清洗干凈后去頭、去內(nèi)臟、去骨，絞碎成勻漿，配成溶液，并調(diào)p H9后，選擇堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件為pH9、溫度50℃、酶與底物比48AU/kg，水解度在34.52%左右時(shí)95℃滅酶活 15min，10000r/min 離心20min，取上清液進(jìn)行真空濃縮、冷凍干燥，得到粗制品，再進(jìn)行超濾、脫鹽，即為魚活性肽。測(cè)得其分子質(zhì)量＜3000D、肽含量80.12%、灰分含量3.58%。

1.3.2 ACE抑制活性的測(cè)定[5-7]

采用高效液相色譜法測(cè)定草魚活性肽對(duì)ACE的抑制活性。在一定條件下，HHL經(jīng)ACE的作用生成馬尿酸和組氨酰亮氨酸，馬尿酸在228nm波長處有最大吸收，因此可以通過馬尿酸的生成量來反應(yīng)ACE的活力的大小。將HHL溶解在0.05mol/L含0.3mol/L氯化鈉的硼酸鹽緩沖液(pH8.3)中，配制成濃度為2.5mmol/L的HHL溶液，依次加入30μL的HHL、10μL草魚肽，37℃恒溫水浴5min，然后加入20μL ACE，恒溫反應(yīng)1h后加入70μLHCl終止反應(yīng)，得到供試液。

式中：S1為對(duì)照馬尿酸峰面積；S2為樣品馬尿酸峰面積。

色譜條件：色譜柱：ODS C18分析型色譜柱(4.6mm×1 5 0 m m，5μm)；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長：228nm；流速：0.8mL/min；流動(dòng)相A：水(含0.05%TFA)；流動(dòng)相B：乙腈(含0.05% TFA)；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃；梯度洗脫條件：10%～60%B(15min)；60%～10%B(3min)。

1.3.3 草魚肽抗氧化能力的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定[8]

DPPH自由基清除率的測(cè)定是利用DPPH溶液的特征紫紅色團(tuán)的吸收峰，以分光光度法測(cè)定加抗氧化劑或植物提取液后吸光度的下降，以此表示對(duì)DPPH自由基的清除能力[9]。用雙蒸水配制一系列濃度梯度的樣品溶液，以無水乙醇溶解DPPH配成濃度為0.1mmol/L。取樣品溶液2mL與2mLDPPH混合均勻，室溫條件下放置30min后測(cè)其517nm波長處吸光度。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

式中：Ai為DPPH溶液與肽液的吸光度；Aj為肽液與無水乙醇的吸光度；A0為DPPH溶液與無水乙醇的吸光度。

1.3.3.2 氧自由基清除能力的測(cè)定

草魚肽氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)的測(cè)定參照Wolfe等[10]的方法，向96孔板各孔分別加入20μL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液或按一定比例稀釋的肽液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品或溶解樣品等均以75mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)為工作液，空白孔直接加入20μL緩沖液，再向每孔中加入 200μL 0.96μmol/L的FL，37℃孵育20min后，用多道移液器迅速向各孔加入20μL新鮮配制的119mmol/L AAPH溶液。立即啟動(dòng)多功能熒光酶標(biāo)儀，在3 7℃條件下以激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長538nm連續(xù)測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度監(jiān)測(cè)熒光衰退情況，每4.5min重復(fù)測(cè)定1次，測(cè)試直至熒光強(qiáng)度曲線衰減到基線為止，熒光強(qiáng)度值分別記為f0、f1、f2、f3…fn。將提取液自由基作用下熒光衰退曲線的延緩面積(Net AUC)代入6.25、12.5、25、50μmol/L標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì) Trolox的Net AUC，與Trolox濃度所做標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到草魚肽的ORAC值，以每克肽中有μmol Trolox當(dāng)量/g肽表示(μmol Trolox/g)[11]。其中AUC＝1＋f1/f0＋f2/f0＋f3/f0＋…＋fn/f0。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度草魚肽對(duì)ACE的抑制活性

ACE可以通過水解作用把血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，同時(shí)，還可以鈍化血管激肽，這兩種作用均可導(dǎo)致血管收縮，引起高血壓[12]。研究發(fā)現(xiàn)，活性肽可以通過抑制ACE的活性而達(dá)到降壓的目的。草魚肽對(duì)ACE的抑制率見圖1，回歸分析得線性方程：y＝48.596x3－153.44x2＋159.07x＋18.079(R2＝0.9977)，規(guī)劃求解其IC50為0.229mg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度草魚肽對(duì)ACE的抑制率Fig.1 ACE inhibitory activity of grass carp peptides at different concentrations

2.2 草魚肽對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖2 為草魚肽對(duì)DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果，回歸分析得線性方程，y＝－0.007x3＋0.0703x2＋5.6885x＋5.6108(R2＝0.9951)，求解得草魚肽對(duì)DPPH自由基清除率的IC50為7.630mg/mL。

圖2 不同質(zhì)量濃度草魚肽對(duì)DPPH自由基的抑制率Fig.2 DPPH free radicals scavenging capacity of grass carp peptides at different concentrations

2.3 草魚肽對(duì)氧自由基的清除能力

圖3 Trolox的熒光衰減曲線Fig.3 FL fluorescence decay curves in the presence of different concentrations of trolox

草魚肽氧自由基清除能力的ORAC值以Trolox當(dāng)量表示，Trolox的熒光衰減曲線如圖3所示。以Trolox的濃度為橫坐標(biāo)，不同濃度下的Net AUC值為縱坐標(biāo)作圖，對(duì)分散點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，即可得到Trolox的Net AUC與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝0.041x＋2.0176(R2＝0.9902)，可知Trolox的Net AUC與其濃度具有良好的線性關(guān)系，根據(jù)公式可求得草魚肽的ORAC值為1317.962μmolTrolox/g。

3 討 論

近年來，隨著生命科學(xué)研究的不斷進(jìn)展，氧化應(yīng)激損傷及抗氧化保護(hù)理論倍受關(guān)注，而高血壓等心腦血管疾病也被公認(rèn)為與氧化應(yīng)激損傷及自由基代謝失調(diào)有關(guān)[13]。因而篩選具有抗氧化及降壓作用的天然資源已成為生命科學(xué)研究的新趨勢(shì)。其中，活性肽就是重要的一類。ACE在血壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，其抑制活性的大小常用指標(biāo)為百分比抑制率和半抑制濃度IC50，前者測(cè)定起來簡單快捷，但缺點(diǎn)是不能比較不同水解物之間的抑制活性大小。IC50是評(píng)價(jià)降壓肽體外抑制活性大小的一個(gè)十分直觀、準(zhǔn)確的指標(biāo)。IC50值越小，抑制肽的活性就越強(qiáng)。近年來，已從多種物質(zhì)中提取到了ACE抑制肽，并驗(yàn)證了顯著的降壓效果，如從小麥胚芽中水解得到的Ile-Val-Tyr (IC50＝0.48μmol/L)[14]，平菇中的 RLPSEFD LSAFLRA(IC50＝ 0.46 mg/mL)和RLSGQTIEVTSEYLFRH (IC50＝1.14mg/mL)[15]，金槍魚中Trp-Pro-Glu-Ala-Ala-Glu-Leu-Met-Glu- Met-Val-Asp-Pro(IC50＝ 21.6μmol/L)[16]等，本實(shí)驗(yàn)通過HPLC法研究了草魚肽的ACE抑制活性，其IC50為0.229mg/mL，具有良好的ACE抑制活性。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過基于基于電子轉(zhuǎn)移的DPPH自由基清除法和H原子轉(zhuǎn)移的ORAC法全面的評(píng)價(jià)了草魚肽的抗氧化性，分別以IC50和ORAC值表示。IC50值越小，清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)，ORAC值越大，對(duì)氧自由基的清除能力越強(qiáng)，其抗氧化性就越強(qiáng)。結(jié)果表明，草魚肽清除DPPH自由基的能力(IC50＝7.630mg/mL)比任瑋等[17]研究的卵白肽(IC50＝5.767mg/mL)和大豆肽(IC50＝6.268mg/mL)較弱，但比玉米肽和海洋膠原肽強(qiáng)。草魚肽ORAC值達(dá)1317.962μmol Trolox/g，而Davalos等[18]測(cè)定了葡萄果汁和葡萄醋的ORAC值分別為25.0、11.5μmol Trolox/g。張芳軒等[19]分析了16個(gè)黑大豆種植間各單體花色苷和總花色苷的ORAC值的變幅為212.5～1834.6μmol Trolox/g，可見草魚肽具有較強(qiáng)的對(duì)氧自由基的清除能力。綜上所述，草魚肽具有良好的ACE抑制活性及較強(qiáng)的抗氧化性，本研究將為草魚肽保健食品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

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in vitroPhysiological Functions of Bioactive Peptides from Grass Carp Meat

LIN Li-mei1，CHEN Ji-wang1，WU Yong-ning2，GONG Zhi-yong1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China；2. China National Center for Food Safety Risk Assessment, Beijing 100021, China)

In this study, bioactive peptides were prepared from grass carp meat by enzymatic hydrolysis and ultrafiltration.Their angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity was determined by high performance liquid chromatography(HPLC) and antioxidant activity was evaluated by DPPH radical scavenging and ORAC (oxygen radical absorbance capacity)assays. The results showed that the prepared bioactive peptides had strong ACE inhibitory activity with IC50 of 0.229 mg/mL.The concentration needed to scavenge 50% DPPH radicals was 7.630 mg/mL and an ORAC value of 1317.962 Trolox μmol/g was achieved. Thus, grass carp meat is a good source of ACE inhibitory peptides.

grass carp peptides；ACE inhibitory activity；DPPH free radical；ORAC

TS254.9

A

1002-6630(2012)15-0034-04

2012-05-15

國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2010AA023003)；武漢工業(yè)學(xué)院校研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2011cx013)

林利美(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：llm2805810@163.com

*通信作者：宮智勇(1966—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称范纠韺W(xué)。E-mail：gongzycn@yahoo.com