王晶鈺，董 睿，王利勤，芮 弦，陳 婷，李成山，張三東，張彥明，郭抗抗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

市售鮮雞蛋中沙門氏菌的分離鑒定及毒力島基因檢測

王晶鈺，董 睿，王利勤，芮 弦，陳 婷，李成山，張三東，張彥明，郭抗抗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

目的：監(jiān)測市售鮮雞蛋中沙門氏菌的污染情況，檢測分離菌株的致病性及其毒力島基因攜帶情況，了解沙門氏菌分離株毒力島基因的攜帶與其致病力的相關(guān)性。方法：從陜西省不同地市的超市中隨機購買鮮雞蛋，無菌取其蛋殼膜分離沙門氏菌，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴增沙門氏菌菌屬特異性invA基因鑒定分離株；對分離菌株進行無特定病原體(SPF)雛雞的致病性試驗，依據(jù)GenBank發(fā)表的基因序列，設(shè)計引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測沙門氏菌毒力島(SPI)核心蛋白基因。結(jié)果：從陜西省55家超市1100枚鮮蛋中分離鑒定出30株沙門氏菌，分離率達2.73%；動物致病性實驗表明，30株沙門氏菌中13株有致病力，其中強致病力菌株有7株，占23.3%；分離菌株的毒力島基因攜帶率分別為：SPI-1 60%、SPI-2 73.3%、SPI-3 100%、SPI-4 90%、SPI-5 76.7%，毒力島基因SPI-1＋SPI-2的攜帶與細菌致病性有關(guān)。結(jié)論：市售鮮雞蛋中沙門氏菌攜帶率為2.73%，分離菌株對動物具有一定的致病力，毒力島基因SPI-1＋SPI-2的攜帶與沙門氏菌的致病性呈正相關(guān)。

沙門氏菌；invA基因；致病性；毒力島基因；雞蛋；蛋殼膜

沙門氏菌屬是一類寄生于人和動物腸道內(nèi)的無芽孢革蘭氏陰性直桿菌，被沙門氏菌污染的禽肉、禽蛋可導(dǎo)致人發(fā)生食物中毒和敗血癥等，人一旦攝入了含有大量沙門氏菌的動物性食品，可導(dǎo)致食源性中毒[1-2]。在美國，每年有將近130萬人感染食源性沙門氏菌，導(dǎo)致500多人死亡[3]，2010年美國有2000多人因食用被腸炎沙門氏菌污染的雞蛋而出現(xiàn)腹瀉等癥狀[4]。目前已經(jīng)明確蛋與蛋制品是引發(fā)人類沙門氏菌病發(fā)生的主要食物媒介。在我國，沙門氏菌引起的食物中毒也是居細菌性食物中毒的首位[5-6]，進出口食品安全檢測監(jiān)控項目中，沙門氏菌屬于不得檢出的微生物種類。因此畜禽產(chǎn)品中，尤其是禽肉和禽蛋中沙門氏菌的存在對食品安全、獸醫(yī)公共衛(wèi)生等具有重要的意義。本研究從陜西省4個不同地市的55個超市中隨機購買鮮蛋，從蛋殼膜中分離鑒定沙門氏菌，對分離菌進行動物致病性實驗，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法檢測沙門氏菌屬毒力島核心蛋白基因，了解市售鮮雞蛋中有無沙門氏菌的污染，分離菌的致病力及其毒力基因的攜帶情況，毒力島基因的攜帶與沙門氏菌的致病性的相關(guān)性，為食品安全提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮮蛋采集：2010年9月至2011年8月，從陜西省的西安、咸陽、寶雞、銅川等市的55個超市隨機購買鮮蛋，每個超市選購20枚，共收集1100枚雞蛋。增菌液及培養(yǎng)基：緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、XLD培養(yǎng)基、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、MH肉湯 北京路橋技術(shù)有限公司。實驗動物：1日齡SPF雛雞93只，由楊凌綠方生物工程有限公司提供(SPF受精蛋購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司)，隔離器中飼養(yǎng)觀察5d，確認健康后進行實驗。

Taq酶試劑盒、PCR Master Mix(TaqDNA聚合酶、dNTP)、DNA Marker DL2000 寶生物工程(大連)有限公司；NaCl 四川西隴化工有限公司；酵母提取物和胰蛋白酶 英國Oxoid公司；溴化乙錠(100mg) 廣州寶泰克生物科技有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；膠回收試劑盒 天跟生化科技有限公司。

DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠紫外成像系統(tǒng) 美國Syngene公司；PCR擴增儀、臺式高速離心機和微量移液器 德國Eppendorf 公司；ZHWY-100B塑殼經(jīng)典型小容量恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋殼膜的采集及前增菌

參照2010年發(fā)布的GB 4789.4—2010《食品微生物學(xué)檢驗》中的沙門氏菌的檢驗方法，將所采集到的雞蛋分別以碘酊和75%的酒精消毒，小心地去除蛋殼，將蛋殼膜用消毒鑷子取下裝入含BPW液的滅菌試管中，37℃培養(yǎng)增菌8h后將BPW液培養(yǎng)物接種到沙門氏菌的選擇性增菌液SC中，37℃進行選擇性增菌18～24h[7-9]。

1.2.2 沙門氏菌選擇性培養(yǎng)

將SC增菌液中沙門氏菌陽性樣本接種于選擇性培養(yǎng)基XLD培養(yǎng)基和BS瓊脂，37℃分別培養(yǎng)18～24h和40～48h。挑選疑似沙門氏菌的單個菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂斜面37℃培養(yǎng)18～24h后4℃保存。使用時接種于MH肉湯培養(yǎng)18h。

1.2.3 沙門氏菌PCR鑒定

1.2.3.1 引物合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的沙門氏菌菌屬特異性invA基因的核苷酸序列[5]，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計一對特異性引物，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，詳見表1。

表1 沙門氏菌invA基因PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in the PCR amplification for invA gene from Salmonella

1.2.3.2 PCR 反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)

PCR反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix(含有2×TaqDNA聚合酶、2×PCR Buffer和2×dNTP)10μ L，10pmol/μL上下游引物各0.5μL，ddH2O 10μL，模板為4μL MH肉湯培養(yǎng)的菌液，總體積為25μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)：為95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，Tm退火30s，72℃延伸45s，共進行30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5μL 用于檢測，用1%瓊脂糖凝膠電泳，在電壓120V，電泳40min左右，以DNA Marker DL2000為參照用凝膠成像儀成像觀察。

1.2.4 沙門氏菌毒力基因PCR檢測

表2 沙門氏菌毒力島核心蛋白基因PCR引物設(shè)計Table 2 Primer sequences used in the PCR amplification for Salmonella SPI genes

根據(jù)G e n B a n k中已發(fā)表的沙門氏菌毒力島(Samonellapathogenicity island genes，SPI)核心蛋白基因[6]，利用Primer 5.0軟件，共設(shè)計5對特異性引物，分別檢測沙門氏菌毒力島核心蛋白基因SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4和SPI-5，反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)同1.2.3.2節(jié)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，詳見表2。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的純化及測序

將PCR擴增的invA基因陽性產(chǎn)物按照膠回收試劑盒說明書進行回收，并將回收產(chǎn)物送到南京金斯瑞生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果與從 GenBank 獲得的相應(yīng)基因片段用DNAStar軟件進行核苷酸序列對比分析。

1.2.6 動物致病性實驗

將93只1日齡SPF健康雛雞隨機分成31組，每組3只，在隔離器中飼養(yǎng)，觀察5d確定健康后用于實驗。1～30組為試驗組，每組分別接種一株菌液，每只皮下接種沙門氏菌肉湯培養(yǎng)物0.2mL(含菌量約2.0×107CFU)；第31組為對照組，每只皮下接種滅菌生理鹽水0.2mL。感染后每日觀察4次，連續(xù)觀察10d，記錄發(fā)病及死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌的分離及invA基因鑒定

通過對蛋殼膜的前增菌及選擇性培養(yǎng)，從1100枚鮮雞蛋樣本中分離出疑似沙門氏菌45株。經(jīng)PCR檢測，在45株疑似沙門氏菌中有30株擴增出396bp大小的沙門氏菌invA基因特異性條帶，與設(shè)計相吻合，測序結(jié)果表明，30株沙門氏菌分離株invA基因序列與GenBank獲得的相應(yīng)基因核苷酸序列的同源性在98.2%～99.8%之間。結(jié)果見圖1。

圖1 invA基因的PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection results of invA gene

2.2 沙門氏菌毒力島核心蛋白基因PCR檢測

對30個沙門氏菌分離株進行了5種毒力島核心蛋白基因檢測，結(jié)果檢出SPI-3陽性菌株30株，檢出率為100%；SPI-1陽性菌株18株，檢出率為60%；SPI-2陽性菌株22株，檢出率為73.3%；SPI-4陽性菌株27株，檢出率為90%；SPI-5陽性菌株23株，檢出率76.7%。結(jié)果見圖2。

圖2 各基因的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection results of 5 SPI genes

2.3 動物致病性實驗

雛雞致病性實驗結(jié)果顯示，30個沙門氏菌分離株中有7株為強致病性菌株，72h內(nèi)能導(dǎo)致3只實驗雛雞全部死亡，剖檢有沙門氏菌病的主要病理變化；6株為中等致病性菌株，72h內(nèi)能導(dǎo)致1～2只實驗雛雞死亡，并有沙門氏菌病的主要病理變化；17株無致病性，72h內(nèi)不能導(dǎo)致雛雞死亡。沙門氏菌分離株的致病性與毒力島基因攜帶情況的關(guān)系見表3。

表3 30個沙門氏菌分離株的致病性與5個毒力島核心蛋白基因的相關(guān)性Table 3 Correlation between 5 SPI genes and pathogenesis of 30 Salmonella strain isolates

2.4 沙門氏菌毒力島基因的攜帶與致病性相關(guān)性分析

表3顯示，30個沙門氏菌分離株中，SPI-1＋SPI-2＋SPI-3＋SPI-4＋SPI-5毒力基因組合檢出的有6株，均有一定的致病力，其中強致病性3株，中等致病性3株；SPI-1＋SPI-2毒力基因組合檢出有11株，均有一定的致病力，其中強致病性6株，中等致病性5株；攜帶SPI-1及SPI-2毒力基因中的一種的有18株，其中16株無致病性，1株為強致病性，1株為中等致病性；毒力基因SPI-4＋SPI-5組合檢出的有21株，其中強致病性4株，中等致病性4株，13株無致病性；攜帶SPI-4及SPI-5毒力基因中的一種的有8株，其中2株無致病性，2株為強致病性，4株為中等致病性；毒力基因SPI-4＋SPI-1組合檢出的有16株，其中強致病性5株，中等致病性5株，6株無致病性；毒力基因SPI-1及SPI-5組合檢測出的有13株，其中5株無致病性，5株為強致病性，3株為中等致病性；毒力基因SPI-2及SPI-4組合檢測出的有19株，其中9株無致病性，4株為強致病性，6株為中等致病性；毒力基因SPI-2及SPI-5組合檢測出的有15株，其中7株無致病性，4株為強致病性，4株為中等致病性。結(jié)果表明，毒力基因SPI-1＋SPI-2組合和SPI-1＋SPI-2＋SPI-3＋SPI-4＋SPI-5毒力基因組合與沙門氏菌致病力有顯著的相關(guān)性，而且攜帶SPI-1菌株的致病性略高于攜帶SPI-2的菌株，但SPI-1與SPI-2的中的哪一種的攜帶對菌株致病性的影響較大，還有待進一步的研究，而SPI-4、SPI-5毒力島基因的攜帶與菌株的致病性并無顯著相關(guān)性。

3 討 論

世界范圍內(nèi)的細菌性食物中毒事件中，沙門氏菌是一種主要的病原菌。在美國，1985—1999年中371例已知的沙門氏菌源性食品中毒事件中，有80%與雞蛋有關(guān)[10]，2010年，美國2000多人因食用被沙門氏菌污染的雞蛋發(fā)生食物中毒后回收超過5.5億枚雞蛋，損失慘重[4]，歐盟發(fā)布的2008年人畜共患疾病和食源性疾病報告中食源性沙門氏菌感染的病例為131468例，在我國，細菌性食物中毒中有70%～80%是由沙門氏菌引起的，而引起沙門氏菌中毒的食品主要是蛋及蛋制品，約占90%[11]， 2011年衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于第2季度全國食物中毒事件情況的通報中，微生物引起的食物中毒達1744例，其中最主要的致病性微生物即為沙門氏菌等[12]。本實驗從1100枚市售鮮雞蛋的蛋殼膜中分離鑒定出沙門氏菌30株，分離率達2.73%。這與王碩[13]、Askari[14]等的研究結(jié)果相近，比Chao[9]、韓磊[15]等的檢出率低。檢測結(jié)果表明我國商品雞蛋中存在一定程度的沙門氏菌污染，生食雞蛋有感染沙門氏菌的風(fēng)險。

沙門氏菌對宿主的致病性與細菌的毒力島基因有關(guān)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌毒力島基因有10余個，其中SPI-1 編碼與侵襲力有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，SPI-2編碼與系統(tǒng)感染有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，SPI-3與沙門氏菌在巨噬細胞內(nèi)存活有關(guān)；SPI-4編碼開放閱讀框架，與Ⅱ型分泌系統(tǒng)和沙門氏菌巨噬細胞內(nèi)存活有關(guān)；SPI-5編碼pipA、pipB、pipC、pipD等基因[16-17]，本研究對30個沙門氏菌分離株中的上述5個主要毒力島核心蛋白基因進行檢測的結(jié)果與田質(zhì)高[6]的研究結(jié)果有差異，其中SPI-3的檢出率相同，而SPI-1、SPI-2和SPI-5檢出率略低，SPI-4基因檢出率略高，這可能與采集的樣品及當(dāng)?shù)亓餍猩抽T氏菌血清型的不同有關(guān)。

在沙門氏菌鑒定方法中，PCR技術(shù)比起傳統(tǒng)生化鑒定具有簡便快速、敏感性高、特異性強等優(yōu)點[5,18]，依據(jù)沙門氏菌種屬特異性的invA基因設(shè)計引物，本研究從45株疑似沙門氏菌中PCR檢測鑒定出30株沙門氏菌，證明了PCR方法檢測的高效和實用性，該方法可用于動物性食品中沙門氏菌的衛(wèi)生監(jiān)督和檢測檢驗。

我國商品雞蛋雖然存在一定程度的沙門氏菌污染，但沙門氏菌對熱較敏感，65℃加熱15min或100℃加熱數(shù)分鐘即可被殺死。我國傳統(tǒng)的鮮蛋及蛋制品烹飪方式大多為煎煮，該過程中持續(xù)的高溫可殺死沙門氏菌，確保蛋及蛋制品的食用安全。

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Isolation, Identification and Pathogenicity Island Gene Detection ofSalmonellain Commercial Eggs

WANG Jing-yu，DONG Rui，WANG Li-qin，RUI Xian，CHEN Ting，LI Cheng-shan，ZHANG San-dong，ZHANG Yan-ming，GUO Kang-kang
(College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Objective: To monitor theSalmonellacontamination status of commercial eggs, detect the pathogenesis and pathogenicity island (SPI) gene ofSalmonellaisolates and their correlation. Methods: Commercial eggs were collected from supermarkets in different cities in Shaanxi province. The eggshell membranes were harvested for isolating and culturingSalmonellain eggs. The strain isolates were identified through the PCR amplification of the special gene invA fromSalmonella. The isolated strains were used for testing the pathogenesis for chicken. According to the sequence of SPI genes published in GenBank, PCR primers were designed to amplify and identify the SPI genes of core proteins. Results: A total of 30Salmonellastrains were isolated from 1100 commercial eggs that were purchased from 55 supermarkets. According to animal pathogenesis tests, 13 strains were pathogenic and 7 strains were strongly pathogenic among theseSalmonellastrains. The carrying rate of SPI gene was 60% for SPI-1, 73.3% for SPI-2, 100% for SPI-3, 90% for SPI-4 and 76.7% for SPI-5. Meanwhile, SPI-1 and SPI-2 revealed an obvious correlation with pathogenesis. Conclusion: The isolation rate ofSalmonellafrom commercial eggs observed in this study is 2.73%.SPI-1 and SPI-2 have a positive correlation with pathogenesis.

Salmonella；invAgene；pathogenesis；SPI；egg；eggshell membrane

S851.347

A

1002-6630(2012)16-0154-05

2011-07-26

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(200903055)

王晶鈺(1964—)，男，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)研究。E-mail：wjingyu2004@126.com