魏鳳玉，方 菊，陳 瑋，楊艷明

(合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

竹葉黃酮在豆?jié){保鮮中的應(yīng)用

魏鳳玉，方 菊，陳 瑋，楊艷明

(合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

采用平板計數(shù)法研究竹葉黃酮(BLF)對豆?jié){中細(xì)菌的抑制作用和保鮮效果。結(jié)果表明：4℃時添加0.01% BLF對豆?jié){的保鮮效果較好，而30℃時BLF的最佳用量為0.015%；感官評定結(jié)果顯示，添加0.01%～0.015%的BLF對豆?jié){的色澤和風(fēng)味均無不良影響，且可使保質(zhì)期延長6h；香蘭素與BLF對豆?jié){的保鮮效果具有一定協(xié)同作用，30℃時添加0.015% BLF與香蘭素質(zhì)量比為4:1的復(fù)合保鮮劑，可使豆?jié){的保質(zhì)期延長8h。

竹葉黃酮；豆?jié){；香蘭素；天然保鮮劑

豆制品富含蛋白質(zhì)、鈣等無機鹽和各種維生素，營養(yǎng)豐富易消化，為中國人最喜愛的食品之一。目前常采用添加化學(xué)防腐劑苯甲酸、山梨酸等[1]對豆制品進行保鮮，但它們可能對產(chǎn)品的口感產(chǎn)生不良的影響，且化學(xué)添加劑可能會對人體產(chǎn)生一定的毒副作用。隨著人們對食品安全性的要求日趨增高，食品防腐劑的天然化、營養(yǎng)化己成為保鮮技術(shù)的發(fā)展趨勢。

竹葉黃酮具有抗自由基、抗氧化等生物活性作用[2-5]，并對常見食物腐敗菌-金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、啤酒酵母和青霉菌有較好抑菌活性[6-7]，因此研究人員探索將其用于食品的防腐保鮮。樓鼎鼎等[8]探索了竹葉黃酮在中式香腸中的應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)添加0.01%～0.02%的竹葉黃酮能顯著增強產(chǎn)品抗氧化性能，且對中式香腸的色澤、風(fēng)味和口感均無不良影響；Zhang Yu等[9]將竹葉提取物應(yīng)用于薯片、炸薯條等膨化食品，研究表明當(dāng)添加0.1%竹葉提取物時，可使食品中丙烯酰胺的含量降低74.1%，同時改善產(chǎn)品的抗氧化性能。竹葉黃酮具有良好的藥理活性、極低的毒副作用[10]和清新甜香的獨特風(fēng)味，作為高效低毒、經(jīng)濟實用的食品防腐劑具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗將竹葉黃酮(bamboo leaves flavonoids，BLF)應(yīng)用于豆?jié){中，結(jié)合低溫和常溫保存，考察其防腐抗菌效果；并將BLF與香蘭素復(fù)配，考察常溫下對豆?jié){保鮮效果的影響，為開發(fā)豆制品的天然防腐劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮毛竹葉采自安徽省六安市；蘆丁對照品(純度99.99%) 中國藥品生物制品檢定所；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、黃豆 市售；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRHS-150B恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；SF-CJ-1凈化工作臺 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；LB-50L立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋 華凌醫(yī)療設(shè)備制造有限公司；ACQUITY UPLC高效液相色譜儀 美國Waters公司；722P可見分光光度計 上海光譜儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 竹葉黃酮制備和分析方法

準(zhǔn)確稱取洗凈、烘干、粉碎過20目篩的竹葉粉末3.0g，按固液比1:18(g/mL)加入60%乙醇溶液，在70℃熱回流提取3次，時間分別為2.5、1.5、1.0h，合并提取液。經(jīng)絮凝除雜后過濾、濃縮除溶劑，用蒸餾水溶解。再將竹葉黃酮水溶液過AB-8大孔樹脂柱吸附，90%乙醇水溶液洗脫，洗脫液旋蒸回收溶劑，將濃縮液烘干，所得固態(tài)物質(zhì)用于HPLC-MS分析，鑒定出BLF中含有4種黃酮物質(zhì)，分別為葒草苷或異葒草苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-β-D-glu(1-2)-α-L-鼠李糖苷，總含量達78.21%。實驗以蘆丁為對照品，采用分光光度法[11]測定BLF中的黃酮含量。

1.3.2 BLF對豆?jié){保鮮的實驗

竹葉黃酮具有廣譜抗菌作用，對食源性菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、β-嗜堿芽孢桿菌等均有顯著的抑制作用[6-7]。根據(jù)文獻[12]報道的竹葉黃酮對大腸桿菌的最小質(zhì)量分?jǐn)?shù)及課題組前期的實驗結(jié)果，確定豆?jié){中BLF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以蘆丁質(zhì)量計，下同)為0.003%、0.01%、0.015%、0.02%。實驗將BLF以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加到新鮮豆?jié){中，密封后分別置于4℃和30℃保存，在不同時間內(nèi)，采用GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗：菌落總數(shù)測定》中的平板計數(shù)法測定菌落數(shù)，以蒸餾水作對照。

1.3.3 BLF與香蘭素復(fù)配對豆?jié){保鮮實驗

香蘭素(vnillin)在食品上除具有增香和定香作用外，還具有殺菌抑菌作用[13]，是一種有應(yīng)用潛力的抗微生物劑，目前已應(yīng)用于牛奶[14]、豆腐[15]和鮮切水果[16]等的保鮮。但vnillin的添加量不易控制，稍過量將對產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生較大的影響。已有研究表明，vnillin與醛、酮和酚等物質(zhì)在抗菌防腐方面有協(xié)同增效作用[17]。由于人工合成vnillin成本較低，若將其與BLF復(fù)配，可實現(xiàn)保鮮劑的高效、價廉、天然無毒。本實驗將B LF和vnillin以質(zhì)量比為1:4、2:3、3:2、4:1進行復(fù)配，控制豆?jié){中復(fù)配物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.015%，考察30℃時復(fù)配物對豆?jié){保鮮效果的影響。

1.3.4 評價指標(biāo)

感官評價：根據(jù)豆?jié){在放置期間色澤、氣味和組織狀態(tài)3方面的變化，制定評分標(biāo)準(zhǔn)，見表1。試驗參加人員10人，均為在校師生。實驗考察BLF及其與vnillin復(fù)配物對豆?jié){不同時間感官的影響，4℃實驗組(EP)添加0.01% BLF，30℃實驗組1(EP1)添加0.015%BLF，實驗組2(EP2)添加0.015% BLF和vanillin復(fù)配物(質(zhì)量比4:1)，空白組(CK)以純豆?jié){作為對比。

表1 豆?jié){感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation of soybean milk

2 結(jié)果與分析

2.1 BLF對抑菌率的影響

表2 BLF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對抑菌率的影響Table 2 Effect of BLF concentration on antibacterial efficacy%

由表2可知，30℃時BLF對豆?jié){的抑菌效果明顯好于4℃，這可能是由于低溫下菌的生長速度較慢，BLF對其抑制作用相對較??；常溫30℃時食源性菌生長較為活躍，使BLF抑菌效果得到了表現(xiàn)，從而具有相對較高的抑菌率。比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)BLF對豆?jié){的保鮮效果可看出，BLF質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，其抑菌效果越好，但加入0.02% BLF后豆?jié){的色澤較深，呈灰黃色，與純豆?jié){的色澤有較大的差別。實驗還發(fā)現(xiàn)，添加BLF后豆?jié){的pH值幾乎不變，綜合考慮，確定4℃和30℃時BLF的添加量分別為0.01%、0.015%。

2.2 BLF與香蘭素復(fù)配對抑菌率的影響

從圖1可看出，純vnillin在豆?jié){中的抑菌作用明顯低于純BLF，且vnillin的抑菌率隨時間變化不明顯，而BLF的抑菌率則隨著時間的延長而提高，這說明BLF的抑菌作用具有較好的持久穩(wěn)定性，對于食品的長時間保鮮有一定的應(yīng)用價值。在vnillin中添加BLF后，其抑菌效果增加，且復(fù)配液中BLF濃度越高，其抑菌效果越好，但當(dāng)復(fù)配液中BLF含量低于80%時，其抑菌效果雖然好于純vnillin但比純BLF還低；只有當(dāng)復(fù)配液中BLF含量為80%時，抑菌效果最好。表明BLF和vnillin對豆?jié){的保鮮有一定的協(xié)同增效作用，可能是由于BLF和vnillin對菌的抑制作用和機理不同，vnillin對豆?jié){前期生長出的菌有較強的抑制性，而BLF的抑菌效果則表現(xiàn)為中后期。綜合對比，選取BLF和vnillin的最佳復(fù)配比為4:1。

圖1 BLF與Vnillin的復(fù)配比對抑菌率的影響Fig.1 Effect of BLF-to-vanillin ratio on antibacterial efficacy

2.3 豆?jié){的感官評價

根據(jù)表1感官評定標(biāo)準(zhǔn)，6～9分時，豆?jié){呈均勻的淡黃色且有豆香味，可供食用，在保質(zhì)期內(nèi)。據(jù)此，從表3可知，4℃時純豆?jié){的保質(zhì)時間約為14h，而加入BLF后，豆?jié){在20h時仍具有豆香味、未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，在20～24h期間開始出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，顏色變深、有異味產(chǎn)生，40h時豆?jié){已變成灰黃色、有強烈的氨味、出水分層嚴(yán)重，完全腐敗，即添加0.01% BLF的豆?jié){保質(zhì)時間達20h，比純豆?jié){延長了6h。溫度升高，豆?jié){腐敗的速率加快，保鮮時間縮短。30℃時純豆?jié){的保質(zhì)時間約為8h，而加入BLF后，豆?jié){在14h時仍具有豆香味，未出現(xiàn)分層現(xiàn)象，在14～22h期間開始出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象(圖2)，即添加0.015%的BLF的豆?jié){保質(zhì)時間約為14h左右，延長了6h；添加0.015% BLF和Vanillin復(fù)配液后，豆?jié){的保質(zhì)時間約為16h左右，延長了8h。

圖2 30℃時豆?jié){中加入BLF與vanillin復(fù)配物20h后的照片F(xiàn)ig.2 Photos of soybean milk stored at 30℃ for 20 h after addition of BLF-vanillin mixture

2.4 竹葉黃酮抑菌機理的探討

因豆?jié){在存放過程中產(chǎn)生的菌落數(shù)較多，因此總菌落數(shù)取以10為底的對數(shù)作為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制豆?jié){中菌的生長曲線。從圖3a可知，4℃時細(xì)菌的生長曲線呈現(xiàn)雙增長峰，BLF對豆?jié){中菌落的生長規(guī)律沒有改變。菌落在0～14h處于對數(shù)生長期，14～20h處于穩(wěn)定期，20～24h處于衰亡期，而24～40h期間豆?jié){菌落數(shù)突增，再次出現(xiàn)生長高峰。此規(guī)律與瓶裝飲用純凈水中細(xì)菌數(shù)量變化的研究結(jié)果極其相似[18]。這可能是豆?jié){中兩種不同類型腐敗菌生長結(jié)果的累加。李博等[19]研究表明，豆制品在放置的不同時期，其內(nèi)部的主要微生物不同。新鮮豆?jié){中主要以芽孢桿菌為主，放置24h后以屎腸球菌為主；新鮮豆?jié){中含有大量的蛋白質(zhì)，芽孢桿菌分解蛋白質(zhì)的能力較強，因而能利用蛋白質(zhì)生長，形成第1個生長高峰，隨著蛋白質(zhì)被逐漸分解，芽孢桿菌的營養(yǎng)物質(zhì)減少，其生長進入衰亡期。而屎腸球菌則利用芽孢桿菌分解蛋白質(zhì)的產(chǎn)物(如氨基酸等)作為營養(yǎng)物質(zhì)，形成第2個生長高峰。由圖3b可看出，30℃時添加0.01%BLF后豆?jié){中菌落的生長規(guī)律同豆?jié){原液相近，菌落在0～16h處于對數(shù)生長期，16～18h處于穩(wěn)定期，18～22h處于衰退期；而添加0.015%和0.02% BLF后豆?jié){中菌落的生長受到了明顯抑制，對數(shù)生長期縮短，14h即到達穩(wěn)定期，16～22h處于衰退期。此時，菌落的生長曲線僅出現(xiàn)一個高峰，符合菌落的一般生長周期[20]，若持續(xù)考察22h后豆?jié){中菌的生長情況，可能也會出現(xiàn)與4℃時相同的現(xiàn)象，形成第2個生長高峰。

表3 豆?jié){的感官評價結(jié)果(n=10)Table 3 Sensory evaluation results for soybean milk (n=10)

抗微生物物質(zhì)的作用方式主要有以下幾種：損傷細(xì)胞壁；改變細(xì)胞的通透性；改變蛋白質(zhì)和核酸分子，抑制酶的作用；作為抗代謝物，抑制核酸的合成等[21]。從圖3還可知，添加一定量的BLF后豆?jié){中的菌落數(shù)降低，表明BLF對菌的生長繁殖和代謝可能均產(chǎn)生了一定的影響，抑制作用發(fā)生在指數(shù)生長期。結(jié)合竹葉黃酮的結(jié)構(gòu)和抗微生物的作用機制，推測BLF的抑菌機理主要有兩種可能：1)BLF為黃酮類物質(zhì)，易與糖類結(jié)合生成黃酮苷，從而能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的糖苷鍵，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其失去對細(xì)胞的保護作用，造成菌體死亡[22]；2)BLF分子中既有親水性基團羥基和疏水基團，親水性基團可以與細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂上的磷酸基形成復(fù)合物，而疏水基團可以插入膜的脂肪酸鏈之間，解聚細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞破裂死亡[20]。有關(guān)BLF的詳細(xì)抑菌機理，有待進一步探索研究。

圖3 BLF對豆?jié){中菌落生長曲線的影響Fig.3 Effect of BLF on growth curve of bacteria in soybean milk

3 結(jié) 論

竹葉黃酮對豆?jié){中的微生物有較好的抑制作用，同時對產(chǎn)品的色澤、質(zhì)地及其他感官品質(zhì)無不良影響。當(dāng)BLF在豆?jié){中的添加量為0.01%～0.015%時，可使豆?jié){的保質(zhì)期延長6 h；香蘭素在豆?jié){中的抑菌作用弱于BLF，但將兩者復(fù)配對豆?jié){的保鮮效果具有一定的協(xié)同作用。30℃時添加0.015%的BLF與香蘭素質(zhì)量比為4:1的復(fù)合保鮮劑，可使豆?jié){的保質(zhì)期從8h延長至16h，增加了8h。竹葉黃酮以其良好的抑菌性、安全無毒和獨特清香，將在豆制品和其他食品的防腐保鮮上具有良好地應(yīng)用前景。

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Application of Bamboo Leaf Flavonoids for Preservation of Soybean Milk

WEI Feng-yu，F(xiàn)ANG Ju，CHEN Wei，YANG Yan-ming
(School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of bamboo leaf flavonoids (BLF) on bacterial inhibition and quality preservation of soybean milk was investigated by plate culture count in the present study. The addition of 0.01% (wt %) BLF has an obvious fresh-keeping effect on soybean milk during storage at 4 ℃, and the optimal BLF dose for preserving soybean milk at 30 ℃ was 0.015% (wt %). Sensory evaluation displayed that 0.01%－0.015% (wt %) of BLF had no impact on the color and flavor of soybean milk, and BLF could prolong its preservation time from 8 h to 14 h. A synergistic effect of vanillin and BLF against spoilage microorganisms in soybean milk was also achieved. The shelf life of soybean milk stored at 30 ℃ could be prolonged from 8 h to 16 h when 0.015%(wt %) of BLF and vanillin mixture (at a mass ratio of 4:1) was applied.

bamboo leaf flavonoids；soybean milk；vanillin；natural preservative

Q946.841

B

1002-6630(2012)18-0312-04

2011-09-02

國家大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃項目(091035947)

魏鳳玉(1963—)，女，教授，博士，研究方向為化工傳質(zhì)與分離。E-mail：weifyliuj@yahoo.com.cn