張 恒，陽承利，呂敬章，湯慕瑾，劉啟頌，萬志剛，謝麗琪，岳振峰，李麗蘇

(1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東 深圳 518045；2.北京大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518055)

Fe3O4@Si-C8/C18復(fù)合磁性納米材料的制備及其在獸藥凈化中的應(yīng)用

張 恒1，陽承利2，呂敬章1，湯慕瑾1，劉啟頌2，萬志剛1，謝麗琪1，岳振峰1，李麗蘇1

(1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東 深圳 518045；2.北京大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518055)

將Fe3O4@Si-C8/C18復(fù)合磁性納米材料應(yīng)用于食品安全中的獸藥凈化領(lǐng)域，采用共沉淀法制備磁性納米前軀體，并在乙醇相中進(jìn)行表面硅化處理及(辛基三甲氧基硅烷)C8/(十八烷基三甲氧基硅烷)C18表面修飾，經(jīng)透射電鏡、X射線、磁性能分析、紅外光譜等手段對所制備的復(fù)合磁性納米進(jìn)行表征，所制備的磁性納米大小均勻，粒徑在100～1000nm范圍內(nèi)可調(diào)，經(jīng)多重修飾后的Fe3O4@Si-C8/C18復(fù)合磁性納米材料其磁性強(qiáng)度沒有明顯降低，并具有表面富集功能。為考察這種磁性納米材料在獸藥提取中的應(yīng)用，選取豆芽中氯霉素殘留的凈化來進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明所制備的復(fù)合型磁性納米材料在小分子凈化富集中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用價值，尤其在食品安全領(lǐng)域。

復(fù)合磁性納米；C8/C18；獸藥凈化

在對小分子提取凈化中，普遍采用傳統(tǒng)方法，如液液萃取等，它們存在自動化程度低、凈化效率低、選擇性差、成本高、勞動強(qiáng)度大、環(huán)境污染嚴(yán)重逐漸不能滿足當(dāng)前儀器分析方法的發(fā)展要求。一些新的樣品處理技術(shù)被應(yīng)用到這個領(lǐng)域，如固相萃取(solid-phase extraction，SPE)[1-6]、基質(zhì)固相分散技術(shù)(matrix solidphase dispersion，MSPD)[7-9]、超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)[10-11]、免疫親和色譜(immunoaffinity chromatography ，IAC)[12-14]等。這些技術(shù)的出現(xiàn)，是對傳統(tǒng)經(jīng)典方法的補(bǔ)充，使前處理技術(shù)簡便高效，選擇性高，樣品用量少，溶劑消耗量少等優(yōu)勢得到發(fā)揮。但縱觀這些技術(shù)，并沒有擺脫人工操作的方式，建立在一些硅膠微球，填料、裝柱、洗柱等流程上，這又大大的限制了樣品處理的高通量，無法真正地實現(xiàn)自動化處理，不能使實驗者從大量繁瑣的前處理工作量中上解放出來。

固相萃取的應(yīng)用最為普遍成熟，SPE柱已是商品化產(chǎn)品，可選擇的品種多，一次性使用,是目前藥物殘留分析前處理的主流技術(shù)，基質(zhì)固相分散技術(shù)對生物組織樣品的處理較有效，但研磨的粒度大小和添裝技術(shù)的差別可能使淋洗曲線有所差異，方法不易標(biāo)準(zhǔn)化。

針對上述小分子類檢測樣品前處理中的不足，難以實現(xiàn)自動化、操作繁瑣等，本實驗室開發(fā)一種制備簡易方法用于制備Fe3O4@Si-C8/C18復(fù)合磁性納米材料，為考證這種磁性納米在小分子提取中的應(yīng)用，選用豆芽中氯霉素的殘留進(jìn)行富集純化作為模型進(jìn)行磁性納米材料的提純應(yīng)用實驗。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)、三氯化鐵(FeC13·6H2O)、氨水(25～28g/100mL)，均為國產(chǎn)分析純 國藥化學(xué)試劑公司；辛基三甲氧基硅烷(C8)、十八烷基三甲氧基硅烷(C18)、正硅酸乙酯 美國Sigma-Aldrich公司。

JEM-2100透射電鏡(100kV) 日本Jeol公司；PC2500粉末X射線衍射 日本Rigaku Corporation公司；Model-155振動樣品磁強(qiáng)計 美國Digital Measurement System公司；IRPrestige-21傅里葉變換紅外光譜儀 日本Shimadzu公司；API 3000TM液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 磁性二氧化硅納米微球的制備[15-16]

在盛有800mL去離子水的2L攪拌式反應(yīng)器中加入0.129mol氯化亞鐵(FeCl2·4H2O)和0.26mol三氯化鐵(FeC13·6H2O)，加入40mL氨水，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，85℃反應(yīng)1h，得到磁性Fe3O4納米前軀體。

稱取0.5g磁性Fe3O4納米前軀體加入到由20mL去離子水、80mL異丙醇、0.75mL濃氨水和適量的正硅酸乙酯的混合溶液中，均勻分散，室溫條件下反應(yīng)24h。用乙醇洗滌數(shù)次，得到磁性二氧化硅納米微球。

1.3 C18/C8在磁性二氧化硅納米微球的偶聯(lián)

取上述預(yù)修飾的納米微球0.5g，加入到400mL無水乙醇中，補(bǔ)加1～4mL去離子水，加入一定體積的辛基三甲氧基硅烷(C8)/十八烷基三甲氧基硅烷(C18)混合液，反應(yīng)12～24h后，加入一定體積的氨水，反應(yīng)1～3h，整個反應(yīng)過程，控制攪拌速度在一定范圍內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后，用乙醇洗滌多次，真空干燥箱中進(jìn)行干燥處理。

1.4 樣品表征

磁性納米微球的形貌采用透射電鏡表征；磁性納米微球的粉末X射線衍射分析在D/max衍射儀上進(jìn)行，Cu靶Kα射線，波長λ＝1.54，掃描范圍10°～70°；磁性納米微球的磁性能采用振動樣品磁強(qiáng)計在室溫條件下測量，測量場強(qiáng)范圍0～8kOe；C18/C8偶聯(lián)的磁性納米微球采用傅里葉變換紅外光譜儀分析。

1.5 Fe3O4@Si-C8/C18納米材料用于分離和富集豆芽中的氯霉素

取上述修飾后的Fe3O4@Si-C8/C18磁性納米材料10.0mg，經(jīng)無水甲醇、氯仿、超純水清洗后備用。取綠豆芽3.0g，加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品終質(zhì)量濃度為0.1μg/kg，攪碎的豆芽制品，加入6 mL乙酸乙酯進(jìn)行混合振蕩1min；2000×g離心10min；對于黃豆芽，取4mL上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，50℃溫和氮流蒸發(fā)乙酸乙酯，然后加入1mL超純水混勻后加入到上述磁性納米中，渦旋混合均勻，室溫靜置1～2min，放置到磁力架上進(jìn)行分離，吸取上清液后，加入500μL超純水進(jìn)行清洗數(shù)次，之后加入一定體積的乙腈進(jìn)行洗脫，吸取上清乙腈溶液進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry/ mass spectrometry，HPLC-MS/MS)檢測。

1.6 儀器條件

色譜條件：色譜柱：BDS-C18(2.1mm×150mm，3.5μm)；柱溫：30℃；流速300μL/min；流動相為水和乙腈混合溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase composition for gradient elution

質(zhì)譜條件：電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)離子模式；離子化溫度：450℃；霧化氣(NEB)：8L/min；氣簾氣(CUR)：10L/min；碰撞氣(CAD)：5L/min；噴霧電壓(IS)：－3900V。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁性納米的制備與形貌表征

磁性納米的制備主要分為前驅(qū)體的制備及其在前驅(qū)體基礎(chǔ)上進(jìn)行的硅層修飾，通過調(diào)整前驅(qū)體與反應(yīng)體系的比例關(guān)系，可以控制所制備二氧化硅納米的大小，粒徑在100～1000nm范圍內(nèi)可調(diào)。如在提取的后續(xù)實驗，所用到的其中一種納米材料如圖1所示，顯示了C8/C18偶聯(lián)的磁性二氧化硅納米的掃描電鏡照片，可以明顯看出，顆粒成球形，且大小分布非常均勻，其平均粒徑為200nm。

圖1 磁性納米Fe3O4@Si-C8/C18投射電鏡圖Fig.1 TEM of magnetic nanoparticle Fe3O4@Si-C8/C18

2.2 粉末X射線衍射

圖2 磁性納米Fe3O4@Si-C8/C18粉末X射線衍射譜圖Fig.2 XRD of magnetic nanoparticle Fe3O4@Si-C8/C18

圖2顯示了C8/C18偶聯(lián)的磁性二氧化硅微球的粉末X射線衍射譜圖，從圖2可以看出，立方晶系尖晶石結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)Fe3O4晶體主要有6個對應(yīng)于{220}、{311}、{400}、{422}、{511}和{440}面網(wǎng)的衍射峰，與磁性微球樣品的6個主要衍射峰對比，它們的峰位置(2θ)和相對強(qiáng)度完全一致，說明磁性微球中所含氧化鐵主要是尖晶石結(jié)構(gòu)的磁性Fe3O4。此外，在15～20°的范圍內(nèi)有一個峰包出現(xiàn)，表明在磁性微球中有無定形的二氧化硅存在。

2.3 紅外光譜圖

圖3 磁性納米Fe3O4@Si-C8/C18紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of magnetic nanoparticles before and after C8/C18 modification

圖3顯示了C8/C18偶聯(lián)前后的磁性二氧化硅微球的紅外光譜圖，從C8/C18偶聯(lián)的磁性二氧化硅微球的譜圖可以看出，在2926cm-1和2850cm-1處有兩個明顯的甲基和亞甲基的收縮振動峰，由此可以證明C8/C18分子偶聯(lián)在微球的表面成功。

2.4 磁性能分析

振動樣品磁強(qiáng)計在室溫條件下測定的磁性二氧化硅微球和C8/C18偶聯(lián)的磁性二氧化硅微球的磁滯曲線見圖4。由圖4可知，磁性二氧化硅微球和C8/C18偶聯(lián)的磁性二氧化硅微球的磁滯曲線均無明顯磁滯現(xiàn)象，在外加磁場等于0時，剩余磁化強(qiáng)度和矯頑力均為0。因此，制備的磁性二氧化硅微球和C8/C18偶聯(lián)的磁性二氧化硅微球都表現(xiàn)出超順磁性。C8/C18偶聯(lián)的磁性二氧化硅微球的比飽和磁化強(qiáng)度為37.8emu/g，比磁性二氧化硅微球的比飽和磁化強(qiáng)度(40.2emu/g)略低一點(diǎn)，這是因為大量的C8/C18分子偶聯(lián)在微球的表面。這也進(jìn)一步證明了C8/C18分子偶聯(lián)在微球的表面是成功的。

圖4 磁性納米Fe3O4@Si-C8/C18磁滯曲線Fig.4 Hysteresis curves of magnetic nanoparticles and C8/C18 modified magnetic nanoparticles

2.5 磁性納米提取豆芽中氯霉素的研究

圖5 基于磁性納米Fe3O4@Si-C8/C18提取豆芽中氯霉素譜圖Fig.5 Ion current chromatograms of chloramphenicol residues in bean sprout purified with magnetic nanoparticles or C8/C18 modified magnetic nanoparticles

所制備的磁性納米經(jīng)無水甲醇、氯仿、超純水清洗后，對水體系中存在的氯霉素溶液進(jìn)行富集，洗脫液采用API3000串聯(lián)質(zhì)譜儀，配ESI-離子源對提取結(jié)果進(jìn)行測定。如圖5所示，未經(jīng)C18/C8修飾的磁性納米不能從溶液中提取出氯霉素，而經(jīng)C18/C8修飾后，能夠很好的從溶液溶液中提取出氯霉素分子，從圖5B可以看到有單一的氯霉素峰譜，與單純的氯霉素溶液對照組(圖5C)的出峰位置是一致的，可見經(jīng)C18/C8修飾的磁性納米能夠用于豆芽中氯霉素的純化，沒有帶入過多的其余雜質(zhì)物質(zhì)，回收率在90%～105%之間。

3 討 論

磁性納米材料由于具有的小粒徑、超順磁性、毒副作用小、易于表面修飾等得以廣泛的應(yīng)用于生物的各種成分如生物細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒、細(xì)菌、抗體、DNA、RNA等分離或純化或免疫分析[17-20]。尤其磁性納米粒子在核酸純化方面得到了充分的發(fā)揮，已有大量的商品化試劑盒供應(yīng)被應(yīng)用于多種體系中DNA的提取和凈化，而未見有報道磁性納米用于環(huán)境、食品等中獸藥小分子的凈化。在進(jìn)行不同體系的檢測中，前處理步驟仍然成為整個檢測的瓶頸，為了使其前處理步驟能夠進(jìn)行自動化，降低前處理中繁瑣的流程，提出了采用經(jīng)不同基團(tuán)對磁性納米材料進(jìn)行修飾，從而能夠從環(huán)境、食品中提取相對應(yīng)的目標(biāo)分子。本實驗主要研究在制備Fe3O4@Si-C8/C18復(fù)合磁性納米材料的基礎(chǔ)上，選取簡單的水環(huán)境體系進(jìn)行初步驗證，通過以上結(jié)果可以看到取得了預(yù)期的效果，采用這種磁性納米能夠很好對水樣中的氯霉素進(jìn)行富集。通過比較單獨(dú)的修飾C8或C18磁性納米材料，其提取效果并沒有同時修飾C8/C18復(fù)合磁性納米材料的效果更理想?？赡芤驗镃8修飾型材料適合分析弱極性物質(zhì)里極性稍強(qiáng)的一類物質(zhì)，C18修飾型材料適合分析弱極性物質(zhì)里極性更弱的物質(zhì)，所以將兩種類型的分子按照一定的比例同時修飾磁性納米上，可以對寬范圍弱極性小分子起到很好的富集和分離。再考慮到C18分子比C8有更長的碳鏈以及存在的空間位阻效應(yīng)，C8分子能彌補(bǔ)C18“龐大”而造成的遺留空間，二者的結(jié)合達(dá)到了較為理想的提取效果。

通過對豆芽中氯霉素的提取進(jìn)行初步的研究，顯示出基于磁性納米材料的表面修飾C8/C18在獸藥小分子提取中具有重要的應(yīng)用潛力，本研究將Fe3O4@Si-C8/C18復(fù)合磁性納米材料應(yīng)用于獸藥小分子的提取，與合適的自動化提取儀器配合，具有潛在的自動化提取能力。同時該磁性納米材料與傳統(tǒng)SPE柱相比，簡化實驗流程，彌補(bǔ)商品化的萃取柱的操作繁瑣，大大的節(jié)省樣品前處理的時間，簡化前處理步驟，有望成為食品安全領(lǐng)域獸藥檢測分析中重要的前處理方法。

[1] CHEN Yong, PAWLISZYN J. Solid-phase microextraction field sampler [J]. Analytical Chemistry, 2004, 76(22): 6823-6828.

[2] CHEN Ligang, WANG Hui, ZENG Qinglei, et al. On-line coupling of solid-phase extraction to liquid chromatography: a review[J]. J Chromatogr Sci, 2009, 47(8): 614-623.

[3] HASEGAWA C, KUMAZAWA T, LEE X P, et al. Pipette tip solidphase extraction and gas chromatography-mass spectrometry for the determination of methamphetamine and amphetamine in human whole blood[J]. Anal Bioanal Chem, 2007, 389(2): 563-570.

[4] JUHASCIK M P, JEKINS A J. Comparison of liquid/liquid and solidphase extraction for alkaline drugs[J]. J Chromatogr Sci, 2009, 47(7): 553-557.

[5] 傅若農(nóng). 固相微萃取(SPME)的演變和現(xiàn)狀[J]. 化學(xué)試劑, 2008, 30 (1): 13-22.

[6] 祝偉霞, 楊冀州, 梁煒, 等. 固相萃取技術(shù)在獸藥殘留分析中的應(yīng)用[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2007, 28(8): 99-101.

[7] 余輝菊, 楊曉松, 楊勝利. 基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法測定蜂蜜中10種磺胺類藥物[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2011, 23(2): 147-150.

[8] BOULAIRE S L, BAUDURET J C, ANGRE F. Veterinary drug residues survey in meat: an HPLC method with a matrix solid phase dispersion extraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(6): 2134-2142.

[9] CRESCENZI C, BAYOUDH S, CORMACK P A, et al. Determination of clenbuterol in bovine liver by combining matrix solid-phase dispersion and molecular imprinted solid-phase extraction followed by liquid chromatography/electrospray ion trap multiple-stage mass spectrometry [J]. Anal Chem, 2001, 73(10): 2171-2177.

[10] ONG C P, LEE H K, LI S F. Supercritical fluid extraction and chromatography of cholesterol in food samples[J]. J Chromatogr, 1990, 515: 509-513.

[11] ANKLAM E, BERG H, MATHIASSON L, et al. Supercritical fluid extraction (SFE) in food analysis: a review[J]. Food Addit Contam, 1998, 15(6):729-750.

[12] AXEN R, PORATH J, ERNBACK S. Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides[J]. Nature, 1967, 214: 1302-1304.

[13] 王建平, 沈建忠. 免疫親和色譜-GC/MS法檢測豬尿中的沙丁胺醇與克倫特羅[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2007, 43(4): 61-62.

[14] 趙思俊, 鄭增忍, 曲志娜, 等. 免疫親和色譜-HPLC-FLD法測定動物肝臟中10種喹諾酮類藥物殘留[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(3): 335-340.

[15] 茍馬玲. 采用化學(xué)共沉淀法制備納米磁流體[J]. 華西醫(yī)學(xué), 2007, 22 (2): 343-344.

[16] TARTAJ P, SERNA C J. Synthesis of monodisperse superparamagnetic Fe/silica nanospherical composites[J]. J Am Chem Soc, 2003, 125(51): 15754-15755.

[17] RUDI K, KROKEN M, DAHLBERG O J, et al. Rapid, universal method to isolate PCR-ready DNA using magnetic beads[J]. Biotechniques, 1997, 22(3): 506-511.

[18] 謝欣. 基于多功能納米磁珠的DNA制備與基因分型[J]. 科學(xué)通報, 2004, 49(6): 541-543.

[19] GU Hongwei, XU Keming, XU Chenjie, et al. Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection[J]. Chem Commun (Camb), 2006(9): 941-949.

[20] MATSUNAGA T, KAWASAKI M, YU Xie, et al. Chemiluminescence enzyme immunoassay using bacterial magnetic particles[J]. Analytical Chemistry, 1996, 68(20): 3551-3554.

Preparation of Compound Magnetic Nanoparticle Fe3O4@Si-C8/C18 and Its Application in Purification of Veterinary Drugs

ZHANG Heng1，YANG Cheng-li2，LU Jing-zhang1，TANG Mu-jin1，LIU Qi-song2，WAN Zhi-gang1，XIE Li-qi1，YUE Zhen-feng1，LI Li-su1
(1. Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518045, China；2. Shenzhen Graduate School, Peking University, Shenzhen 518055, China)

In this paper, we first applied compound magnetic nanoparticle Fe3O4@Si-C8/C18 to purify veterinary drugs, and co-precipitation method was employed to synthesize the precursor of magnetic nanoparticles. The surface of nanoparticle precursor was silicified in ethanol and modified with C8 (octyltrimethoxysilane)/C18 (octadecyltrimethoxysilane) to prepare composite magnetic nanoparticle Fe3O4@Si-C8/C18. The compound magnetic nanoparticles were characterized by TEM, X-ray, magnetic performance analysis, and infrared spectroscopy. These compound magnetic nanoparrticles revealed high uniformity with adjustable particle diameters of 100－1000 nm. Therefore, after several layer-by-layer modifications, the compound magnetic nanoparticle revealed the same magnetic intensity as its original precursor. In order to validate their application possibility in the purification of veterinary drugs, purification of chloramphenicol residues in bean sprout was conducted using these magnetic nanoparticles. The results demonstrated that these compound magnetic nanoparticles had extensive application value for the purification and enrichment of micromolecules, especially in the field of food safety.

compound magnetic nanoparticle；C8/C18；purification of veterinary drug

O652.6

A

1002-6630(2012)18-0108-05

2011-07-12

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2009IK154)

張恒(1982—)，男，工程師，碩士，研究方向為食品安全快速檢測篩選技術(shù)。E-mail：yzhangheng@163.com