翟 為，張美雙，張莉霞，趙 巖,*，吳 鵬，張連學(xué),*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.九江中星聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江西 九江 332000)

復(fù)合酶法提取海帶多糖工藝優(yōu)化

翟 為1，張美雙1，張莉霞1，趙 巖1,*，吳 鵬2，張連學(xué)1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.九江中星聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江西 九江 332000)

以海帶為原料，復(fù)合酶法提取海帶多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)及方差分析確定復(fù)合酶法提取海帶多糖的最佳條件：纖維素酶0.5%、果膠酶1.0%、木瓜蛋白酶1.0%、木聚糖酶1.0%、溫度30℃、時(shí)間3h、pH 5.0。在此條件下，海帶中多糖的提取率為78.9%。使用復(fù)合酶前處理工藝，海帶多糖產(chǎn)率較傳統(tǒng)工藝提高了近3倍。

海帶；復(fù)合酶；海帶多糖

海帶(Laminaria Japonica)又名昆布，屬于褐藻門、海帶科、海帶目，是一種大型的可食用藻類，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。早在 1400 多年前，我國(guó)人民就逐漸對(duì)海帶的食用性能有所認(rèn)識(shí)，在《本草經(jīng)疏》和《食療本草》等專著中都有海帶功能的記載[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究已經(jīng)揭示，海帶具有多方面的生物活性，如：降血糖[4]、降血脂、降血壓[5-6]、抗凝血[7-8]、抗腫瘤[9-11]、抗菌、病毒[12]、調(diào)節(jié)免疫、抗輻射[13-14]等，這些功能在很大程度上與其所含有的生理活性物質(zhì)——多糖有關(guān)。因而，如何能從海帶中最大限度地提取多糖，且不破壞多糖的生物活性，對(duì)保持細(xì)胞健康，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，從而實(shí)現(xiàn)人體健康有重要的意義。

目前，世界范圍內(nèi)提取海帶多糖方法大部分屬于純化學(xué)方法[15-16]，此法提取海帶多糖由于降解問題不僅產(chǎn)率普遍較低(一般在20%左右)，而且大量的酸堿化學(xué)藥品對(duì)環(huán)境的污染較大。而酶作為一種特殊的以蛋白質(zhì)形式存在的生物催化劑，在啤酒、果汁果酒、紡織、飼料、皮革、酒精生產(chǎn)等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，并以其特異、高效、綠色環(huán)保等特點(diǎn)而備受青睞。目前酶解提取法提取海帶多糖還不夠成熟，僅有少量的文獻(xiàn)報(bào)道使用單一酶進(jìn)行水解的方法[17-18]，但組成植物細(xì)胞壁的有纖維素酶、半纖維素酶、果膠、木質(zhì)素等成分，他們之間的鏈接方式或者鑲嵌，或者抱合，所以用單一的酶很難徹底破解植物的細(xì)胞壁，不能使內(nèi)容物完全釋放。因此，本研究以蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、木聚糖酶按科學(xué)的配比制成復(fù)合酶，對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)海帶中多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，從而得出最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海帶，選用市場(chǎng)上出售的干燥完整的海帶。

木瓜蛋白酶(2×106U/g)、纖維素酶(2.6×105U/g)、果膠酶(4×104U/g)、木聚糖酶(3×105U/g) 江西九江中星聯(lián)生物科技有限公司；濃鹽酸、濃硫酸等試劑均為分析純。

電子恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；SHZCD真空抽濾機(jī) 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AN0837電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TP3102分析天平 余姚倫銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海帶多糖提取工藝

1.2.1.1 傳統(tǒng)提取工藝[19]

工藝流程：海帶→浸泡除雜→堿溶消化→減壓抽濾→濾液酸凝過夜→中和→醇析→減壓抽濾→沉淀物→烘干→粗多糖制品。

操作要點(diǎn)：稱取1g洗凈的干燥海帶，然后加入2%碳酸鈉溶液40mL，于55℃消化2.0h；減壓抽濾，取濾液，用5%鹽酸使海帶多糖以膠態(tài)析出，靜置過夜，向靜置液中緩緩加入稀鹽酸，調(diào)pH1～2后過濾；在常溫下，邊攪拌邊加入2%碳酸鈉溶液溶解膠塊，至pH7.5中和完成；向中和后的溶液中加入一定量的無(wú)水乙醇析出沉淀；過濾，沉淀物于40～50℃烘箱中干燥，即得海帶多糖。

1.2.1.2 酶法提取工藝

工藝流程：海帶→浸泡除雜→酶解→滅酶→堿溶消化→減壓抽濾→濾液酸凝過夜→中和→醇析→減壓抽濾→沉淀物→烘干→粗多糖制品。

操作要點(diǎn)：稱取1g洗凈的干燥海帶，按1:50(g/mL)的料液比加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和一定體積分?jǐn)?shù)的酶，在一定溫度和pH值下酶解一定時(shí)間，升溫滅酶；剩余操作同1.2.1.1節(jié)中操作要點(diǎn)。

1.2.2 多糖測(cè)定

采用干質(zhì)量法計(jì)算粗多糖的質(zhì)量，苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，確定多糖純度[20]。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選用纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及木聚糖酶4種酶，在酶各自的適宜條件下對(duì)海帶進(jìn)行水解，分別考慮各單酶的最適提取條件。

1.2.4 多糖提取的正交試驗(yàn)

以單因素酶解試驗(yàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行正交試驗(yàn)L8(27)，確定復(fù)合酶法提取海帶多糖的最佳條件，優(yōu)化提取工藝。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用方差法進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)提取工藝結(jié)果

按照“1.2.1.1 傳統(tǒng)提取工藝”中操作要點(diǎn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到傳統(tǒng)工藝海帶多糖的平均提取率為21.6%，其多糖含量平均值為49.81%。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 最適酶解pH值的確定

分別考察了木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶在不同pH值，加酶量均為0.5%、50℃酶解3.0h、2%碳酸鈉溶液40mL于55℃消化2.0h的提取效果，結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH值對(duì)多糖得率的影響

十八大報(bào)告明確指出：“加大非公有制經(jīng)濟(jì)組織、社會(huì)組織黨建工作力度”“擴(kuò)大黨組織和黨的工作覆蓋面”“創(chuàng)新基層黨建工作，夯實(shí)黨執(zhí)政的組織基礎(chǔ)”。因此，正確把握新形勢(shì)下非公有制經(jīng)濟(jì)組織黨組織建設(shè)現(xiàn)狀，分析其面臨的新情況新特點(diǎn)，及時(shí)跟進(jìn)黨組織設(shè)置，加大在非公有制經(jīng)濟(jì)組織中黨建工作的力度，仍然是當(dāng)前各級(jí)黨委面臨的重要課題。

Fig.1 Effect of pH on the yield of polysaccharides

由圖1可知，4種酶均在弱酸性條件下有較好的酶解效果，最適pH值分別為6.0、6.0、5.0、6.0。

2.2.2 最適酶解時(shí)間的確定

保持其他條件不變，分別考察木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶在不同酶解時(shí)間下，pH值分別為6.0、6.0、5.0、6.0的多糖提取結(jié)果，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

Fig.2 Effect of hydrolysis time on the yield of polysaccharides

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖的得率也不斷上升。至3h木聚糖酶處理的粗多糖得率達(dá)最大值。此后粗多糖得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)平緩或急劇下降(纖維素酶)，以木聚糖酶下降最為明顯。因此確定最佳酶解時(shí)間為3h。

2.2.3 最適酶解溫度的確定

圖3 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the yield of polysaccharides

由圖3可知，隨著溫度的增加，木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶的作用效果為先升高后下降，且分別在50、60、60℃時(shí)達(dá)到最大值。纖維素酶作用效果隨溫度升高呈遞減趨勢(shì)，在30℃時(shí)的多糖得率最高，因而在其酶促反應(yīng)的適宜溫度應(yīng)在30℃或更低。

2.2.4 最適加酶量的確定

木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶分別在pH值為6.0、6.0、5.0、6.0，酶解時(shí)間均為3h，溫度分別為50、60、60、30℃，其他條件不變，在不同加酶量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的條件下多糖的提取結(jié)果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 加酶量對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the yield of polysaccharides

由圖4可知，隨著酶量的增加，多糖提取量均明顯增加，且在添加量達(dá)到0.5%后粗多糖得率上升的很緩慢(木瓜蛋白酶)甚至下降。因此，確定4種酶的最適加酶量均為0.5%。

2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了優(yōu)化提取工藝，選取纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶、木聚糖酶、溫度、時(shí)間、pH值7個(gè)因素對(duì)多糖提取影響較大的因素，設(shè)計(jì)L8(27)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 復(fù)合酶法提取海帶多糖正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design arrangement and corresponding results

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis for the experimental results of orthogonal array design

如表1、2所示，通過方差分析，各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的主次順序依次為：C、F、A、D、B、G、E。其中，C和F因素影響比較顯著，其最優(yōu)水平分別為C2和F1。對(duì)于其他因素，其最優(yōu)水平分別為：A1、B2、D2、E2、G1，但由于均為非顯著因素，考慮到原輔料成分及能耗等因素，選取水平分別為：A1、B2、D2、E1、G1。綜合以上，確定復(fù)合酶法提取海帶多糖的最佳工藝條件為：A1B2C2D2E1F1G1，即纖維素酶0.5%、木瓜蛋白酶1.0%、果膠酶1.0%、木聚糖酶1.0%、溫度30℃、酶解時(shí)間3h、pH5.0，在此條件下多糖的提取率為78.9%。采用苯酚-硫酸法測(cè)定粗多糖中多糖含量，得其純度為51.26%。

3 結(jié) 論

單因素試驗(yàn)中，pH值方面，木聚糖酶、木瓜蛋白酶、果膠酶和纖維素酶均在弱酸性條件下有較好的酶解效果，最適pH分別為6.0、6.0、5.0、6.0。這是由于在最適pH值時(shí)，酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適于與底物結(jié)合，而過酸或者過堿條件下，酶的空間結(jié)構(gòu)受到了破壞，影響了與底物的結(jié)合，從而使多糖的提取率下降[21]；酶解時(shí)間方面，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖的得率也不斷上升。至3h木聚糖酶處理的粗多糖得率達(dá)最大值。此后粗多糖得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)平緩或(纖維素酶)急劇下降，以木聚糖酶下降最為明顯。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間過長(zhǎng)，多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或降解，從而使多糖的提取率下降[22]，因此確定4種酶的最適酶解時(shí)間均為3h。

海帶細(xì)胞壁主要由多糖和蛋白質(zhì)組成。纖維素酶水解纖維素，使細(xì)胞壁破裂；果膠酶通過對(duì)果膠質(zhì)的解酯、水解、破裂作用，促進(jìn)多糖從細(xì)胞中釋放到提取液中；而木聚糖酶和木瓜蛋白酶加速了細(xì)胞組織的崩解，提高了纖維素酶和果膠酶的作用效果。4種酶相互作用，使其結(jié)果高于單一酶作用效果，顯著提高了海帶多糖的提取率。

傳統(tǒng)工藝從海帶中提取海帶多糖的提取率為21.6%，而復(fù)合酶法的提取率為78.9%，海帶多糖產(chǎn)率較傳統(tǒng)工藝提高了近3倍，而且多糖純度相當(dāng)。與傳統(tǒng)工藝相比，加入了相當(dāng)于原料質(zhì)量0.5%～1.0%的酶，成本僅相當(dāng)于新增產(chǎn)出的1/4，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。為復(fù)合酶在海帶多糖提取工藝的應(yīng)用提供了可能性。

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Optimization of Multi-Enzyme Hydrolysis ofLaminaria japonicafor Polysaccharide Extraction

ZHAI Wei1，ZHANG Mei-shuang1，ZHANG Li-xia1，ZHAO Yan1,*，WU Peng2，ZHANG Lian-xue1,*
(1. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. Jiujiang Starlink Biotech Co. Ltd., Jiujiang 332000, China)

This study was designed to optimize the extraction of polysaccharides fromLaminaria japonicaby one-step hydrolysis with four different enzymes. By using orthogonal array design and analysis of variance based on one-factor-at-atime experiments, the optimal hydrolysis conditions for polysaccharide extraction fromLaminaria japonicawere 0.5% cellulase,1.0% pectinex, 1.0% papain, 1.0% xylanase, extraction temperature of 30 ℃, extraction time of 3 h and pH 5.0. Under these conditions, the extraction yield of polysaccharides was 78.9%, which was increased approximately 3-fold compared with that obtained by the traditional extraction method.

Laminaria japonica；multiple enzymes；polysaccharide

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0006-04

2011-08-25

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI03B01)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31070316)

翟為(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯芯颗c開發(fā)。E-mail：zhw2010062@163.com

*通信作者：趙巖(1979—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯芯颗c開發(fā)。E-mail：zhyjlu79@163.com張連學(xué)(1955—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参?。E-mail：zlx863@163.com