查登峰

·實(shí)驗(yàn)研究·

高效液相測(cè)定血中谷氨酰胺的研究

查登峰

目的 探討高效液相色譜法測(cè)定血中谷氨酰胺的含量。方法 固定相反相C18(規(guī)格:0.46 mm×250 mm)，流動(dòng)相為50 mmmol/L醋酸緩沖液(pH為6.5):乙腈(97.7∶2.3)，流速1.0 ml/min，柱溫46℃，檢測(cè)波長為254 nm，進(jìn)樣量取10 μl。結(jié)果 谷氨酰胺在濃度范圍(0.05～2.60)μg/ml之間有良好的線性關(guān)系，r=0.9989，批間、批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.87%、2.58%，兩種高低濃度的回收率分別為102.9%、97.0%。結(jié)論 本研究方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，為血中谷氨酰胺的含量測(cè)定提供了科學(xué)、專屬的方法。

高效液相色譜法;血清;谷氨酰胺

目前有很多研究顯示，谷氨酰胺(GLN)為人體中大多器官與組織所需的特殊營養(yǎng)物質(zhì)，故亦稱“基本營養(yǎng)素”，系腸外營養(yǎng)的重要成分［1］。但GLN不溶于水，遇熱不穩(wěn)定等，因此只能經(jīng)雙肽鍵以丙氨酸與其結(jié)合，合成穩(wěn)定丙氨酰-谷氨酰胺的雙肽分子，此雙肽分子進(jìn)入機(jī)體后可很快分解成單體的谷氨酰胺與丙氨酸，因此雙肽鍵在人體中打開率對(duì)丙氨酰-谷氨酰胺注射液在臨床上應(yīng)用的藥效評(píng)價(jià)是十分重要。本文筆者通過測(cè)定血中GLN濃度及血清GLN健康者的參考值，分別對(duì)丙氨酰谷氨酰胺注射液(商品名:多蒙特，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字:H20043702)和另外丙氨酰-谷胺酰胺注射液(國內(nèi)某制藥有限公司)，探索我院行腹部大手術(shù)患者采用經(jīng)谷氨酰胺強(qiáng)化安全腸外營養(yǎng)后血清中的GLN濃度情況。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀(美國，490型紫外檢測(cè)器，510型輸液泵，U6K進(jìn)樣器，PICO-TAG色譜柱，810色譜工作站)，微孔濾膜(美國，Millipore公司)。

乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純;谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司);異硫氰酸苯酯(美國Pierce公司);丙氨酰谷胺酰胺注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司);丙氨酰谷胺酰胺注射液(國內(nèi)某制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為固定相反相C18(規(guī)格:0.46 mm×250 mm)，流動(dòng)相為50 mmmol/L醋酸緩沖液(pH為6.5):乙腈(97.7∶2.3)，流速每分鐘 1.0 ml，柱溫 46℃，檢測(cè)波長為254 nm，進(jìn)樣量取 10 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 準(zhǔn)確稱取18.45 mg GLN標(biāo)準(zhǔn)品，以50 ml超純水溶解混勻，即得2.5 mmmol/L GLN標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃可保存。準(zhǔn)確量取20 μLGLN標(biāo)準(zhǔn)溶液加至100 μL患者的血清中，充分混勻，即為標(biāo)準(zhǔn)血清。另外加入超純水20 μL于100 μL血清中，充分混勻，即為標(biāo)準(zhǔn)空白血清。標(biāo)準(zhǔn)血清與標(biāo)準(zhǔn)空白血清同時(shí)超濾，取濾液，分別為標(biāo)準(zhǔn)液與標(biāo)準(zhǔn)空白液。

2.3 待測(cè)血清樣本液的制備 抽取100 μL患者血清進(jìn)行超濾，得無蛋白超濾液，即為待測(cè)的血清樣本液。

2.4 衍生反應(yīng) 分別量取加入超純水20 μl、20 μl三乙胺及140 μl無水乙醇加入異硫氰酸苯酯中，充分混勻，即得衍生試劑，需現(xiàn)配現(xiàn)用。準(zhǔn)確稱取355 mg磷酸氫二鈉，加入450 ml超純水進(jìn)行溶解，以10%磷酸-乙腈(95∶5)混合溶液調(diào)PH為7.4，加水定容至500 ml，充分混勻，即得樣品稀釋液，于4℃冰箱保存。分別量取20 μl處理過的血清，在真空條件下抽干，加入20 μl衍生試劑，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)20 min，然后再真空抽干，加入 1000 μl的樣品稀釋液，混勻，量取 10 μl進(jìn)樣。

2.5 線性關(guān)系考察 量取2.5 mmol/L GLN標(biāo)準(zhǔn)溶液，以超純水對(duì)倍進(jìn)行稀釋，分別獲得7個(gè)濃度:2.500、1.250、0.625、0.312、0.156、0.078 與 0.039 mmol/L，各取 20 μl，衍生和測(cè)定。橫坐標(biāo)為GLN濃度(C)，縱坐標(biāo)為峰面積(A)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示GLN標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度范圍(0.05～2.60)mmol/L之間有良好的線性關(guān)系，r=0.9989。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取12份1.25 mmol/L GLN標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得批間變異系數(shù)為2.87%，批內(nèi)變異系數(shù)為2.58%。

2.7 干擾試驗(yàn) 取混合氨基酸標(biāo)樣(不含GLN)，分為兩份，其中一份加至350 μmol/L的GLN中，兩份均按照上述方法處理并進(jìn)樣。結(jié)果顯示GLN峰保留時(shí)間為11.09 min，其鄰近2個(gè)峰分別為β-丙氨酸(保留時(shí)間12.33 min)、甘氨酸(保留時(shí)間10.02 min)，GLN峰位置沒有受到任何氨基酸及其他雜峰干擾。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別在衍生0、2、4、6 h精密吸取同一血清標(biāo)本10 μl，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示RSD=0.020%，說明血清標(biāo)本在室溫6 h內(nèi)的穩(wěn)定性佳。

2.9 回收試驗(yàn) 分別取2份健康人群的血清，均按照找上述方法測(cè)定GLN濃度，分別獲得結(jié)果為597、608 mmol/L，再分別加入1.25、0.156 mmol/L兩種高低濃度GLN標(biāo)準(zhǔn)溶液，各10 μl，混勻，依法測(cè)定GLN的濃度，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示兩種高低濃度的回收率分別為102.9%、97.0%。

3 討論

2001年國外已有研究采用高效液相色譜法測(cè)定GLN，其在GLN衍生后以磷酸緩沖液-甲醇行單泵恒定溶劑的等梯度洗脫［2］。近年來國內(nèi)學(xué)者認(rèn)為采用單泵恒溶劑洗脫，GLN與雜峰不能徹底地分離，故以雙泵雙流動(dòng)相行梯度洗脫［3］。但是梯度洗脫需配置2個(gè)梯度混合器與輸液泵。而事實(shí)上采用高效液相色譜法分離單一組分，其能否與雜峰徹底分開很大程度取決于能否獲得流動(dòng)相中水相(緩沖液)和有機(jī)相(乙腈、甲醇)的最佳比例。本研究結(jié)果顯示，GLN在乙腈濃度為2.3%時(shí)分離效果最好，采用單泵恒溶劑洗脫即與其他雜峰完全分離，分析時(shí)間僅需15 min，同時(shí)峰形佳。

本研究在處理樣品時(shí)運(yùn)用離心超濾法除去血中蛋白質(zhì)。有文獻(xiàn)指出取血漿0.4 ml超濾，得20 μl超濾液即可行衍生與色譜分析［4］。本文筆者認(rèn)為外標(biāo)法因受到超濾膜吸附與殘留影響，超濾血漿后體積發(fā)生變化，此時(shí)測(cè)得的GLN含量與實(shí)際濃度必然具有一定的差異。本研究為了保持實(shí)驗(yàn)條件一致性，消除上述誤差，故取同一血清分為標(biāo)準(zhǔn)血清與標(biāo)準(zhǔn)空白血清2份，均與相同的條件下超濾、衍生反應(yīng)及色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)血清與標(biāo)準(zhǔn)空白血清峰面積之差計(jì)算結(jié)果，即作為標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)際峰面積來計(jì)算待測(cè)血中GLN含量，使結(jié)果更可靠、準(zhǔn)確。

本研究采用PITC作為GLN的衍生劑，因其在實(shí)驗(yàn)過程中不受時(shí)間的限制［5］，而衍生產(chǎn)物于室溫條件下保存6 h后結(jié)果也不存在顯著的差異，于檢測(cè)波長254nm處具有特征峰吸收，且無其他雜峰的干擾，獲得了滿意的結(jié)果。

近年來臨床上采用谷氨酰胺強(qiáng)化的完全腸外營養(yǎng)來對(duì)危重患者及術(shù)后患者進(jìn)行治療與護(hù)理。本臨床試驗(yàn)也表明，實(shí)驗(yàn)組患者于手術(shù)前后連續(xù)7 d采用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(多蒙特，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)的腸外營養(yǎng)后，血中GLN濃度明顯高于對(duì)照組采用的丙氨酰-谷胺酰胺注射液(國內(nèi)某制藥有限公司)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。本研究方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，為血中谷氨酰胺的含量測(cè)定提供了科學(xué)、專屬的方法。

［1］ Poindexter BB，Ehrenkranz RA，Stoll BJ，et al.Parenteral glutamine supplementation does not reduce the risk of mortality or lateonset sepsis in extremely low birth weight infants.Pediatrics，2004，113(5):1209-15.

［2］ Gu Y，Wu ZH，Xie JX，et al.Effects of growth hormone(rhGH)and glutamine supplemented parenteral nutrition on intestinal adaptation in short bowel rats.Clin Nutr，2001，20(2):159-66.

［3］ Hasebe M，Suzuki H，Mori E，et al.Glutamate in enteral nutrition:can glutamate replace glutamine in supplementation to enteral nutrition in burned rats?.JPEN J Parenter Enteral Nutr，1999，23(5 Suppl):S78-82.

［4］ Neu J，DeMarco V，Weiss M.Glutamine supplementation in lowbirth-weight infants:mechanisms of action.JPEN J Parenter Enteral Nutr，1999，23(5 Suppl):S49-51.

［5］ Lai YN，Yeh SL，Lin MT，et al.Glutamine supplementation enhances mucosal immunity in rats with Gut-Derived sepsis.Nutrition，2004，20(3):286-91.

333000江西省景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院藥劑科

2.10 血清GLN的參考值測(cè)定 取30份健康人群的空腹血清標(biāo)本，均按照上述方法測(cè)定GLN濃度，獲得結(jié)果(616.8±67.9)μmol/L。

2.11 臨床試驗(yàn) 選取我院行腹部大手術(shù)患者共30例，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組各15例。其中實(shí)驗(yàn)組患者于術(shù)前3天始采用用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(多蒙特，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)0.5 g/kg，連續(xù)治療6 d;而對(duì)照組患者采用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(國內(nèi)某制藥有限公司)，用法同實(shí)驗(yàn)組。兩組患者分別在術(shù)前3 d及術(shù)后3、7 d測(cè)定GLN濃度(見表1)。

兩組患者用藥前后血清中谷氨酰胺濃度比較見表1。結(jié)果顯示，術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組患者血清中的谷氨酰胺濃度明顯高于對(duì)照組患者約10%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 兩組患者用藥前后血清中谷氨酰胺濃度比較(±s，μmmol/L)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) 術(shù)前3 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d實(shí)驗(yàn)組 15 603±70 500±43 608±59*對(duì)照組15 605±61 482±39 552±51