張 朋，沈 潔，劉福康，王婷婷，印 虹，孫桂菊*

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009)

不同骨密度測量方法在補(bǔ)鈣劑評價中的應(yīng)用

張 朋，沈 潔，劉?？担蹑面?，印 虹，孫桂菊*

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009)

目的：評價某補(bǔ)鈣為主保健食品增加大鼠骨密度的功效，比較雙能X線吸收法(DEXA)與阿基米德定律法在骨密度測量中的應(yīng)用。方法：參照《保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)評價規(guī)范》(2003版)“增加骨密度功能檢驗(yàn)方法”方案一，將45只斷乳Sprague-Daw ley大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為碳酸鈣對照組、低鈣對照組和保健品低、中、高劑量組(0.17、0.33、1.00g/kg)，對某保健食品進(jìn)行評價。結(jié)果：保健品高劑量組及碳酸鈣對照組大鼠在鈣表觀吸收率、質(zhì)量增加量、骨密度及骨鈣含量上明顯高于低鈣對照組(P＜0.05)。除骨密度外，保健品高劑量組同碳酸鈣對照組相比各指標(biāo)差異不顯著；DEXA法與阿基米德定律法所測骨密度結(jié)果相關(guān)性較好。結(jié)論：該保健食品對大鼠有增加骨密度作用；DEXA法與阿基米德定律法均可用于動物實(shí)驗(yàn)中骨密度的測定。

大鼠；骨密度；X線吸收法；阿基米德定律

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會進(jìn)步，人們的健康狀況不斷改善，健康意識也不斷增強(qiáng)。盡管如此，公眾在飲食習(xí)慣上仍存在著不合理之處。在鈣攝入方面，絕大部分人達(dá)不到《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》中推薦量(800m g/d)的要求[1-2]。對嬰幼兒、孕婦、絕經(jīng)期婦女及中老年人等特殊人群而言，鈣是比較容易缺乏的營養(yǎng)素之一，攝入足量的鈣對促進(jìn)骨骼發(fā)育、增加骨密度及改善骨質(zhì)疏松癥狀具有重要的作用[3-6]。在這種情況下，具有增加骨密度功能的保健食品越來越受到人們的青睞。

目前我國用于對這類保健食品功效評價的標(biāo)準(zhǔn)為《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》中“增加骨密度功能檢驗(yàn)方法”，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)這一方案存在些許不妥之處，現(xiàn)以某以補(bǔ)鈣為主的保健食品為受試物驗(yàn)證并評價該方法中方案一部分，并比較雙能X線吸收法(dualenergy X-ray absorptiometry，DEXA)法與阿基米德定律法在骨密度檢測中的應(yīng)用效能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

某保健食品(含碳酸鈣25%，其余為D-鹽酸氨基葡萄糖、VK1、骨碎補(bǔ)提取物等) 哈藥集團(tuán)制藥六廠，批號為20100105；鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液 環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所，批號101505。

QDR-4000型骨密度儀 美國Hologic公司；LA型固體骨密度儀 德國Sartortus公司；9602A型火焰原子吸收分光光度計(jì) 沈陽華光精密儀器有限公司。

1.2 方法

按照文獻(xiàn)[7]中“增加骨密度功能檢驗(yàn)方法”中方案一進(jìn)行。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雌性SD大鼠45只，體質(zhì)量73～93g，購于浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(浙)2008-0033，動物使用許可證號：SYXK(蘇)2008-0003。

1.2.2 鈣吸收實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3周后進(jìn)行3d鈣代謝實(shí)驗(yàn)。記錄3d內(nèi)飼料的攝入量與糞便、尿液的排泄量。使用原子吸收分光光度法測定飼料、糞樣和尿樣中鈣含量，計(jì)算鈣表觀吸收率和鈣保留率。

1.2.3 骨密度實(shí)驗(yàn)

大鼠適應(yīng)環(huán)境3d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為低鈣對照組，保健品低、中、高劑量組和碳酸鈣對照組。其中，低鈣對照組使用去離子水灌胃干預(yù)90 d，保健品低、中、高3個劑量組依次給予劑量為0.17、0.33g/kg和1.00g/kg的保健品去離子水溶液進(jìn)行干預(yù)，此干預(yù)劑量相當(dāng)于該保健食品的5、10倍和30倍的人體推薦攝入量。碳酸鈣對照組使用鈣含量與保健品高劑量組相同的去離子水溶液灌胃干預(yù)。

每周測體質(zhì)量1次，干預(yù)90d后處死大鼠。取左側(cè)股骨經(jīng)105℃烘干至質(zhì)量恒定，分別使用骨密度儀(DEXA法)及固體骨密度儀(阿基米德定律法)測股骨密度；以濕硝化法硝化股骨，使用原子吸收分光光度法測定骨鈣含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS13.0進(jìn)行方差分析，不符合方差分析條件的先進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，否則使用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 保健品樣品對大鼠鈣吸收的影響

由表1可見，不同組別大鼠在鈣的吸收上存在一定差別。碳酸鈣對照組、保健品高劑量組及中劑量組大鼠鈣表觀吸收率，其差異顯著高于低鈣對照組(P＜0.05)；而各組別大鼠的鈣保留率上看則相差不大，差異沒有顯著性。

表1 保健品樣品對大鼠鈣吸收的影響Tab le 1 Com parisons of apparent calcium absorp tion rate, calcium retention rate among different rat groups

2.2 保健品樣品對大鼠體質(zhì)量的影響

表2 保健品樣品對大鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Com parison of body weight gain am ong different rat groups

由表2可見，實(shí)驗(yàn)初，各組大鼠體質(zhì)量之間差異不顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在體質(zhì)量方面，碳酸鈣對照組大鼠同低鈣對照組相比差異顯著(P＜0.05)；碳酸鈣對照組及保健品高劑量組大鼠在體質(zhì)量增加量上同低鈣對照組相比差異顯著(P＜0.05)。

2.3 保健品樣品對大鼠骨密度及骨鈣含量的影響

表3 保健品樣品對大鼠骨密度的影響Table 3 Com parison of bone m ineral density among different rat groups

由表3可見，由骨密度結(jié)果來看，低鈣對照組骨密度均顯著低于其余各組(P＜0.05)。碳酸鈣對照組同保健品高劑量組相比盡管給予的鈣含量相同，但骨密度均值相對較小。碳酸鈣組的股骨中點(diǎn)密度及整根股骨密度顯著低于保健品高劑量組(P＜0.05)。

將兩種方法所測骨密度數(shù)據(jù)做Pearson相關(guān)，并定義P＜0.01時為有效，所得結(jié)果見表3。結(jié)合P值可以判定，固體密度儀法與DEXA法所測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 保健品樣品對大鼠骨鈣含量的影響Tab le 4 Com parison of bone calcium content among different rat groups

由表4可見，碳酸鈣對照組、保健品高劑量組大鼠骨鈣含量同低鈣對照組相比顯著升高(P＜0.05)，其中高劑量保健品組大鼠骨鈣含量高于碳酸鈣對照組，但兩組間差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性。

3 討 論

《保健食品檢驗(yàn)與技術(shù)評價規(guī)范》(2003版)“增加骨密度功能檢驗(yàn)”方案一中規(guī)定，骨鈣含量或骨密度顯著高于低鈣對照組且不低于相應(yīng)劑量碳酸鈣對照組，鈣的吸收率不低于碳酸鈣對照組，可判定受試物具有增加骨密度功能的作用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中鈣代謝實(shí)驗(yàn)、體質(zhì)量、骨密度結(jié)果和骨鈣含量結(jié)果可以判定，受試物具有增加骨密度功能。

在對鈣的代謝情況上看，原方法僅考慮的表觀吸收率，并未考慮保留率的情況。鈣保留率體現(xiàn)了機(jī)體對鈣的消化吸收的情況，考慮了經(jīng)口攝入機(jī)體的鈣經(jīng)過一系列代謝轉(zhuǎn)化后經(jīng)過尿液排泄的情況。在鈣保留率的基礎(chǔ)上探討鈣吸收率的差異，結(jié)果更可信。以低鈣飼料飼喂生長發(fā)育期大鼠時，鈣缺失導(dǎo)致的營養(yǎng)不良會直接影響其體格的增長；而在補(bǔ)鈣的同時補(bǔ)充其他有益骨代謝的物質(zhì)，可以促進(jìn)大鼠生長發(fā)育[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)?zāi)?，碳酸鈣對照組和保健品高劑量組大鼠體質(zhì)量的增加明顯大于低鈣對照組，且保健品高劑量組的鈣吸收率和保留率與碳酸鈣組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；就骨密度結(jié)果而言，碳酸鈣對照組同保健品高劑量組相比盡管給予的鈣的量相同，但碳酸鈣對照組骨密度均值相對較小，可能是因?yàn)槎喾N功效成分的復(fù)合作用促進(jìn)了鈣的吸收。

文獻(xiàn)[7]中規(guī)定，測定骨密度時可使用單光子骨密度儀、雙能X線骨密度儀或相關(guān)儀器。而臨床上測骨密度診斷骨質(zhì)疏松的“金標(biāo)準(zhǔn)”是DEXA[9-10]。DEXA法是非創(chuàng)傷性測量手段，主要利用骨組織對能量吸收的差異，推算骨組織的密度值，以單位面積上骨礦物質(zhì)含量作為骨密度。此法掃描速度快，精密度與準(zhǔn)確度高，但受骨幾何尺寸影響[11]，且儀器體積大，攜帶不便，價錢昂貴，具有放射性污染，只能固定在有防護(hù)裝置的實(shí)驗(yàn)室使用。固體密度測量儀測定骨密度的原理是基于阿基米德定律。利用股骨的排水量計(jì)算體積，結(jié)合質(zhì)量求出骨密度。這樣得到的骨密度為真正意義的物理密度。除此以外，固體密度儀還具有快速、經(jīng)濟(jì)、便攜、無放射性污染、操作過程簡單等優(yōu)點(diǎn)。

在國外，應(yīng)用阿基米德定律測定骨密度是測定小動物骨密度的標(biāo)準(zhǔn)方法，后來有學(xué)者經(jīng)研究驗(yàn)證DEXA法所測骨密度與阿基米德定律測定結(jié)果具有高度相關(guān)性才將其應(yīng)用于小動物實(shí)驗(yàn)中[12]。M cClure等[13]以馬身上不同部位的骨骼作為研究對象，以阿基米德定律法作為標(biāo)準(zhǔn)，也進(jìn)行過類似的研究。此外，還有一些學(xué)者在研究中應(yīng)用過阿基米德定律測量骨密度[14-18]。

在本實(shí)驗(yàn)中，盡管骨密度測量方法與數(shù)據(jù)結(jié)果單位不同，但從數(shù)值上看，隨著灌胃劑量的變化不同方法測得的骨密度均呈現(xiàn)出一致的變化趨勢。從Pearson相關(guān)系數(shù)來看，相關(guān)系數(shù)r值均大于0.5，屬于顯著相關(guān)，說明這兩種方法的相關(guān)性較好，即兩種方法均能有效區(qū)分不同組別間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對人而言，人們無法測定其真實(shí)骨密度，只能采用DEXA法或其他方法；在動物實(shí)驗(yàn)中，完全可以采用阿基米德定律的辦法，提供更加直接和準(zhǔn)確的骨密度數(shù)據(jù)。因此，這兩種方法均可應(yīng)用于增加骨密度功能保健食品的功效檢驗(yàn)中。

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Application of Different Bone Mineral Density Measurements in the Assessment of Calcium Supplement

ZHANG Peng，SHEN Jie，LIU Fu-kang，WANG Ting-ting，YIN Hong，SUN Gui-ju*
(School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China)

Objective: To assess the enhancing effect of a commercially available calcium supplement on bone m ineral density in rats and to compare the application of dual energy X-ray absorptiometry (DEXA) and Archimedes, principle bone m ineral density. Methods: According to Protocol 1 from Method for Testing the Function of Increasing Bone Density,, 2003Technical Standards for Testing and Assessing of Health Food, 45 weaned SD rats were divided at random into calcium carbonate control group, low calcium control group, and high-dose, medium-dose and low-dose calcium supplement groups (adm inistered at doses of 1.00, 0.33 g/kg and 0.17 g/kg, respectively). Results: The high-dose group showed a significant increase in apparent calcium absorption rate, body weight gain, and bone mineral density and calcium content when compared w ith the low-dose group (P＜0.05). All indexes investigated except bone m ineral density indicated no significant difference between the high-dose and calcium carbonate control groups. There was a good correlation between the results of bone m ineral density determ ination by the DEXA method and Archimedes, principle. Conclusions: The calcium supplement has an enhancing effect on bone mineral density in rats. Moreover, the DEXA method and Archimedes, principle are both applicable for the determ ination of bone m ineral density.

rats；bone m ineral density (BMD)；dual energy X-ray absorptiometry (DEXA)；A rchimedes, principle

R336

A

1002-6630(2012)05-0272-03

2011-09-07

張朋(1985—)，男，碩士研究生，主要從事食品毒理與食品功效研究。E-mail：zp109324215@163.com

*通信作者：孫桂菊(1963—)，女，教授，博士，主要從事食品毒理與食品功效研究。E-m ail：g jsun@seu.edu.cn