汪財生，汪樂意，高有領*，譚志文，楊震峰

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

響應面法優(yōu)化根霉菌產麥角固醇的液體發(fā)酵工藝

汪財生，汪樂意，高有領*，譚志文，楊震峰

(浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

以米根霉(Rhizopus oryzaeZW017)發(fā)酵產麥角固醇的產量為響應值，對其液體發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。采用HPLC法檢測菌株產麥角固醇含量，在單因素篩選試驗基礎上，以PDB液體發(fā)酵培養(yǎng)為基礎條件，應用響應面分析法(RSM)對碳源、氮源及發(fā)酵時間進行優(yōu)化。結果表明：以葡萄糖、酵母膏分別為最佳碳、氮源；最佳工藝條件為：PDB基礎培養(yǎng)基中添加葡萄糖3g/L、酵母膏5g/L、發(fā)酵培養(yǎng)9.64d，麥角固醇平均產量達5761.83μg/100mL，較優(yōu)化前提高了247.86%，與構建模型理論預測值(5818.39μg/100mL)相吻合，且100mL液體培養(yǎng)基中麥角固醇產量占菌體細胞干質量(0.36g)的1.60%。

根霉菌；麥角固醇；響應面分析法

麥角固醇(C28H43OH)又名麥角甾醇，化學名稱為24β-甲基膽固醇-5,7-烯-3β-羥基，在常溫下麥角固醇呈白色片狀晶體或針狀晶體，相對分子質量396.63，不溶于水，易溶于石油醚、乙醚、庚烷等有機溶劑。麥角固醇是一種重要的醫(yī)藥化工原料，可用于“可的松”、“激素黃體酮”及“蕓苔素內酯”等藥物的生產，也是脂溶性VD2的前體，當受到紫外線照射時可轉化為VD2，具有很高的經濟價值[1]。由于我國生產麥角固醇的能力低，生物合成途徑尚處于不成熟階段，而且麥角固醇轉化成VD2的工藝比較落后，但我國對VD2的需求量又很大，其生產遠遠不能滿足市場的需求，每年需要從國外進口一定量的麥角固醇，因此，麥角固醇的研究開發(fā)有很大的市場。

麥角固醇主要存在于植物和一些真菌的質膜上[2]。目前，國外主要采用微生物發(fā)酵法生產麥角固醇，所用的菌種有酵母菌、曲霉和青霉，其產量分別可達細胞干質量的2.7%、2.0%和1.8%左右[3-4]；由于他們重視高產菌株的選育，以及對影響麥角固醇產生的代謝調控、發(fā)酵條件優(yōu)化等研究，其生產一直處于穩(wěn)中有升的趨勢[4-5]。國內于20世紀50年代起開始對酵母產麥角固醇進行研究，主要用酵母菌、黑曲霉及紅曲霉固體發(fā)酵生產麥角固醇，產量相對較低，僅為細胞干質量的0.8%～1.2%[4]；如朱效剛等[6]利用紅曲霉SJS-20固態(tài)發(fā)酵，麥角固醇產量達到細胞干質量的0.82%，陳松生等[7]以Monascus purpureus625進行液體發(fā)酵，得到麥角固醇產量為菌體干質量的1.68%左右，寧瑋霽等[8]以紅曲霉Monascussp. ZZ為菌種進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌體干質量1.13%的麥角固醇，李國友等[9]從根霉3078菌絲體的甲醇提取物中分離得到9種化合物并對其進行波譜分析，結果檢測到麥角甾醇的產生，該麥角甾醇被鑒定為5a,8a-表二氧-(20S,22E,24R)-麥角甾-6,22-二烯-3-醇。筆者在以PDB培養(yǎng)基篩選高產植酸酶實驗中發(fā)現(xiàn)一株高產麥角固醇根霉菌。因此，本試驗采用響應面法對影響該菌株產麥角固醇的主要碳源、氮源、培養(yǎng)時間進行優(yōu)化，以期為工業(yè)化高效生產麥角固醇及綜合開發(fā)根霉菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

米根霉(Rhizopus oryzaeZW017)由王國良教授提供，浙江萬里學院省重點微生物學科實驗室保存。

斜面及平板培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)基 天津市永大化學試劑開發(fā)中心。

麥角固醇(純度≥99.8% 美國Sigma公司；甲醇、乙腈(色譜純) 天津市四友精細化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

QYC-211型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將斜面保存的菌種轉接到平板培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)5～7d，待平板培養(yǎng)基長出大量根霉菌孢子后，用吐溫-80輕輕洗下，無菌水調整孢子濃度至107個/mL左右備用。

1.3.2 基礎發(fā)酵

在250mL三角瓶裝基礎發(fā)酵培養(yǎng)基100mL，將液體種子按10%接種量接入培養(yǎng)基中，于28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)3d，每次處理設3個平行實驗，收集菌體測定麥角固醇含量，取平均值，并以此為對照實驗。

1.3.3 碳源的篩選

1.3.3.1 不同碳源對麥角固醇產量的影響

將葡萄糖、乳糖、蔗糖分別以3g/L加入基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中進行單因素篩選試驗，每種碳源設3個平行實驗，測定菌體麥角固醇產量，取其平均值。

1.3.3.2 不同質量濃度碳源對麥角固醇產量的影響

將1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L不同質量濃度的最佳碳源分別加入到基礎培養(yǎng)基中進行單因素試驗，每個質量濃度平行實驗3次，測定菌體麥角固醇產量，取其平均值。

1.3.4 氮源的篩選

1.3.4.1 不同氮源對麥角固醇產量的影響

將蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2SO4分別以3g/L添加到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中進行單因素試驗，每種氮源設3個平行實驗，測定菌體麥角固醇產量，取其平均值。

1.3.4.2 不同質量濃度氮源對麥角固醇產量的影響

將1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L最佳氮源分別加入基礎培養(yǎng)基中進行單因素試驗，每個質量濃度設3個平行實驗，測定菌體麥角固醇產量，取其平均值。

1.3.5 發(fā)酵時間對麥角固醇產量的影響

將PDB基礎發(fā)酵培養(yǎng)基接種，按1.3.2節(jié)方法分別于發(fā)酵3、4、7、9、11、13d后收集菌體，密封冰凍保存，同批處理每個時間設3個平行實驗，測定菌體麥角固醇產量，取其平均值。

1.3.6 響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)上述單因素試驗結果，以菌體麥角固醇產量為響應值，采用響應面分析方法(RSM)研究幾個發(fā)酵因素間交互作用對米根霉產麥角固醇的影響，以確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，設計響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件，再借助軟件Design Expert(Version7.1.3)對結果進行分析，以篩選最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，并對結果進行驗證。RSM試驗設計如表1所示。

表1 米根霉液體發(fā)酵產麥角固醇Box-Benhnken試驗設計因素水平編碼水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.7 米根霉菌體生物量與麥角固醇產量測定

1.3.7.1 菌體收集與生物量計算

將三角瓶中菌體發(fā)酵液轉移至500mL離心管中，10000r/min離心10min，棄上清液，蒸餾水洗滌沉淀2次，重復離心，所得菌體于真空干燥箱50～60℃烘干至質量恒定，準確稱取其質量。生物量用100mL液體培養(yǎng)基中菌體質量表示。

1.3.7.2 麥角固醇提取

參照文獻[10]，對上述計算生物量后的菌體采用皂化-乙醚萃取-乙醇溶解定容法進行麥角固醇樣品的提取與制備。

1.3.7.3 麥角固醇含量檢測

采用HPLC檢測方法[10]，并進行改進。選用Agilent ODS C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流速1.2mL/min，柱溫35℃，檢測波長282nm，檢測每100mL液體培養(yǎng)基的菌體中麥角固醇含量。

2 結果與分析

2.1 麥角固醇含量測定標準曲線

配制不同質量濃度的6個麥角固醇標準樣品，采用液相色譜儀在波長282nm處測得色譜圖，其中3.3μg/mL標樣圖譜見圖1。此色譜工作條件下儀器精密度為1.40%(n＝5)，平均加標回收率達104.20%(n＝5)，表明儀器性能良好，誤差較低，麥角固醇色譜峰與雜質有較好的分離效果；麥角固醇標準曲線回歸方程為：y＝18.325x－11.689，相關系數(shù)R2＝0.9996，麥角固醇在3.3～165μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，可以用來檢測樣品中的麥角固醇含量。

圖1 麥角固醇標樣及樣品分離色譜圖Fig.1 Chromatographs of ergosterol standard and samples

2.2 基礎發(fā)酵實驗結果

以PDB培養(yǎng)基為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵3d收集1 00mL液體培養(yǎng)中菌體，測得麥角固醇的產量為1656.35μg/100mL。

2.3 添加不同碳源對麥角固醇產量的影響

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基礎上選擇添加葡萄糖、乳糖、蔗糖為補充碳源，結果見圖2。上述3種碳源都有利于米根霉菌體產麥角固醇量提高，當添加葡萄糖作為補充碳源時，麥角固醇產量最高，菌體產3150.29μg/100mL麥角固醇，因此，后續(xù)選擇葡萄糖為最佳添加碳源。

圖2 不同碳源及氮源對米根霉菌體麥角固醇產量的影響Fig.2 Effects of carbon and nitrogen source types on ergosterol production

2.4 添加不同葡萄糖質量濃度對麥角固醇產量的影響

圖3 不同質量濃度葡萄糖對米根霉菌體麥角固醇產量的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on ergosterol production

如圖3所示，隨葡萄糖質量濃度升高，菌體干細胞中麥角固醇的產量逐漸升高。當葡萄糖質量濃度為4g/L時，菌體中所產的麥角固醇接近最大值4331.62μg/100mL，之后有降低趨勢，表明麥角固醇在菌體中富集到一定程度，原因可能是在麥角固醇產生合成過程中，羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的作用受到抑制[11]，此外，也與菌體中葡萄糖分解代謝相關的酶趨于飽和不再結合底物有關。

2.5 添加不同氮源對麥角固醇產量的影響

如圖2所示，添加不同氮源對菌體中產生麥角固醇的產量影響也較為明顯。在基礎液體培養(yǎng)中添加4種氮源中，酵母膏最有利于菌體產生麥角固醇，其產量可達2828.1μg/100mL。因此，基礎培養(yǎng)中添加酵母膏為最佳氮源。

2.6 添加不同質量濃度酵母膏對麥角固醇產量的影響

液體發(fā)酵培養(yǎng)中添加不同質量濃度酵母膏后，結果如圖4所示，隨著酵母膏質量濃度的增加，菌體中麥角固醇的產量隨之增高。當添加酵母膏質量濃度至4g/L時，達到峰值(4124.36μg/100mL)，之后，麥角固醇的產量隨之降低。此現(xiàn)象可能與麥角固醇的產生受抑制有關，表明添加適當質量濃度的酵母膏有利于米根霉菌體發(fā)酵產麥角固醇。

圖4 不同質量濃度酵母膏對米根霉菌體麥角固醇產量的影響Fig.4 Effect of yeast extract concentration on ergosterol production

2.7 發(fā)酵時間對米根霉產麥角固醇的影響

圖5 不同發(fā)酵時間對米根霉菌體麥角固醇產量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on ergosterol production

從圖5可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，麥角固醇的產量逐漸增加，當發(fā)酵時間達到9d后，菌體麥角固醇產量出現(xiàn)峰值(4337.62μg/100mL)，之后，隨著培養(yǎng)時間延長，麥角固醇的產量降低明顯。這與發(fā)酵過程中隨著培養(yǎng)基中菌體生物量的不斷增加，營養(yǎng)物質消耗得不到補充或某種營養(yǎng)物質缺乏造成營養(yǎng)不均衡時，菌體發(fā)生自溶有關。因此，米根霉產麥角固醇較佳發(fā)酵時間為9d左右。

2.8 響應面優(yōu)化發(fā)酵條件結果

根據(jù)表2，利用Design Expert軟件對試驗結果進行二次多元回歸擬合，得到麥角固醇產量對自變量A、B和C的二次多項回歸方程為：Y＝4717.4－428.8A＋544.6B－45.4C－84.8AB－515.5AC－314.4BC＋68.6A2＋72.3B2－110.9C2。

為了使方程具有更好的擬合性，根據(jù)Sampaio等[12]采用的方法，除去方程中的AB、A2和B2項，得到優(yōu)化的二次回歸方程為：Y＝4794.9－428.8A＋544.6B－45.4C－515.5AC－314.4BC－121.0C2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 響應面二次模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the results of Box-Behnken experimental design

由表3可知，模型的F值為4.58，表明該模型顯著(P＜0.05)，失擬項P＝0.8027，表明由誤差引起的失擬不顯著。模型的決定系數(shù)為0.8746，說明方程的因變量與全體自變量間線性關系明顯；模型的變異系數(shù)值為6.9，說明模型的精密度較好，具有足夠的信號來用于響應該設計。綜合以上各參數(shù)表明該試驗方法可靠，各因素水平間設計合理，因此可用該回歸模型代替實驗真實點對實驗結果進行分析預測?；貧w模型各項的方差分析結果還表明，A、AC項為顯著項，B項為極顯著項(P＜0.01)，其余項均不顯著。

2.9 優(yōu)化發(fā)酵條件的確定及驗證

以表2結果對培養(yǎng)基中菌體生物量與菌體產麥角固醇量之間進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)其并不存在直接的相關性，菌體生長中麥角固醇生物合成的特定抑制劑濃度以及其他與麥角固醇反應的成分，溫度、pH值都可能影響真菌的液態(tài)新陳代謝，并且可能影響真菌細胞膜中麥角固醇濃度[13]。因此，米根霉液體發(fā)酵產麥角固醇最佳工藝條件優(yōu)化在本試驗設計中不考慮菌體生物量。

由優(yōu)化后的二次回歸模型可得到等高線圖和三維響應面圖(圖6)，在圖中橫坐標分別為發(fā)酵時間與碳源質量濃度(葡萄糖)兩個變量，另一變量酵母膏質量濃度(圖中未表示)已處于當麥角固醇產量最高時的最佳值(5g/L)。二次回歸模型計算結果表明在本試驗設定的變量范圍內，100mL液體培養(yǎng)基中的菌體最高可產麥角固醇量為5818.39μg。此時最優(yōu)化的各項自變量分別為：3g/L葡萄糖、5g/L酵母膏、發(fā)酵培養(yǎng)時間9.64d。依此條件進行根霉菌液體發(fā)酵重復培養(yǎng)得到菌體麥角固醇平均產量5761.83μg/100mL，菌體平均生物量0.36g，麥角固醇平均達菌體干細胞質量的1.60%左右，與模型預測值(5818.39μg/100mL)接近，反映了本響應曲面模型的可靠性。

圖6 葡萄糖質量濃度與發(fā)酵時間交互作用對米根霉液體發(fā)酵產麥角固醇影響的響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of fermentation time and glucose concentration on ergosterol production

3 結 論

3.1 采用響應面分析法對米根霉產麥角固醇條件進行了初步優(yōu)化，在PDB為液態(tài)發(fā)酵基礎培養(yǎng)基，28℃、孢子液接種量2%、振蕩培養(yǎng)3d條件下，100mL發(fā)酵培養(yǎng)液平均產麥角固醇1656.35μg；液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件為：基礎培養(yǎng)基中添加3g/L葡萄糖、酵母膏5g/L、發(fā)酵培養(yǎng)9.64d，麥角固醇產量較優(yōu)化前提高了247.86%，平均可達5761.83μg/100mL，約為菌體干細胞質量的1.60%，與構建模型的預測值(5818.39μg/100mL)接近，說明響應面模型可很好地應用于米根霉產麥角固醇的發(fā)酵條件優(yōu)化。

3.2 本實驗結果提示根霉菌是一株優(yōu)良的麥角固醇產生菌，但由于菌體生長的條件與麥角固醇合成的條件不一致，未能考慮菌體生長對產麥角固醇的影響。因此，通過對菌體生長及麥角固醇合成的其他條件，如溫度、pH值、微量元素等進行優(yōu)化培養(yǎng)，并進行工程菌誘導方面的研究，將更有利于提高米根霉菌產麥角固醇的能力，為工業(yè)開發(fā)應用微生物生產麥角固醇具有重要意義。

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Application of Response Surface Methodology for Optimization of Liquid-State Fermentation Process for Ergosterol Production byRhizopus oryzae

WANG Cai-sheng，WANG Le-yi，GAO You-ling*，TAN Zhi-wen，YANG Zhen-feng
(College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China)

In order to maximize intracellular ergosterol production inRhizopus oryzaein liquid-state fermentation, nitrogen and carbon sources and fermentation time were optimized using response surface methodology. Ergosterol was determined by HPLC and the fermentation medium used was based on PDB liquid medium. The effects of carbon and nitrogen source types on ergosterol production were examined. One-factor-at-a-time experiments were conducted to analyze the effects of yeast extract,glucose and fermentation on ergosterol production. The optimum carbon and nitrogen sources were found to be glucose and yeast extract, respectively. The optimum fermentation process was achieved after 9.64 d of culture in a modified PDB liquid medium containing 3 g/L glucose and 5 g/L yeast extract. Under these conditions, the average ergosterol production was 5761.83μg /100 mL of fermentation broth, which was in agreement with the predicted value (5.818.39μg /100 mL of fermentation broth) from the model established and 247.86% higher than before the optimization. Moreover, the ratio of ergosterol to dry cell was 1.60%(100 mL liquid culture medium).

Rhizopus oryzaeZW017；ergosterol；response surface methodology

Q815；Q939.9

A

1002-6630(2012)05-0229-05

2011-02-24

浙江省科技廳重大科技專項(2009C12239)；寧波市科技局農業(yè)科技攻關項目(2006C100093)

汪財生(1969—)，男，高級實驗師，研究方向為活性物質提取與開發(fā)。E-mail：wangcaisheng@zwu.edu.cn

*通信作者：高有領(1978—)，男，講師，博士，研究方向為發(fā)酵工程和活性物質開發(fā)。E-mail：gaoyol@gmail.com