李 潔，孫 姝，朱科學*，彭 偉，周惠明

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

半干面腐敗菌的分離與鑒定

李 潔，孫 姝，朱科學*，彭 偉，周惠明

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

目的：探究引起半干面腐敗變質(zhì)的主要微生物類群。方法：采用形態(tài)學鑒定和生理生化鑒定的手段，對導致半干面腐敗的主要微生物進行分離和鑒定。結(jié)果：半干面中以芽孢桿菌屬(Bacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)為優(yōu)勢腐敗菌群；經(jīng)分離鑒定的優(yōu)勢細菌有枯草芽孢桿菌(Bacillius subtills)、地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黃色葡萄球菌(S. aureus)；分離鑒定的霉菌主要有白曲霉(Aspergillus candidus)、雜色曲霉(A. versicolor)和圓弧青霉(Penicillum cyclopium)。芽孢桿菌是半干面貯藏前期最主要的細菌，但隨著貯藏時間的延長，葡萄球菌大量生長繁殖，成為半干面中的優(yōu)勢細菌。

半干面；腐敗菌；分離；鑒定

半干面被稱為“第四代方便面”，是經(jīng)過和面、熟化、壓片、切條、部分脫水、包裝而成的面條。其加工過程中不需油炸或高強度脫水，含水量在22%～25%左右，是一種具有很大發(fā)展?jié)摿Φ男滦透咚址奖忝酌嬷破穂1]。一方面，半干面溫和的加工工藝賦予了其爽口、有嚼勁、面香味濃等優(yōu)點，也迎合了消費者對食物在健康、安全方面的要求；但另一方面，半干面含水量高、營養(yǎng)豐富的特點又導致了微生物生長繁殖迅速，面條極易腐敗變質(zhì)[2]。為尋找行之有效的半干面保鮮措施，必須對引起半干面腐敗的主要菌群的種類及特性進行深入研究。但國內(nèi)外的相關(guān)報道較少。國內(nèi)僅有周文化等[3]對生鮮濕面的菌相進行了分析，認為引起生鮮濕面霉變的主要是毛霉(Mucor)和青霉(Penicillum)，但未對腐敗細菌進行分離鑒定；Jensen等[4]對澳大利亞多個超市出售的高濕面條的微生物進行了調(diào)查分析，結(jié)果表明，冷藏濕面中的主要腐敗菌為大腸菌群、乳酸細菌、酵母菌和霉菌。

本實驗擬對半干面中的腐敗菌進行分離鑒定，從而為進一步針對性地尋找有效的保鮮措施，延長半干面的貨架期提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉：中糧面業(yè)鵬泰精制粉(水分含量12.20%，灰分含量0.65%，蛋白質(zhì)含量13.48%)；食鹽：淮牌精制食用鹽。

1.2 儀器與設備

5K5SSWH和面機 美國Kitchen Aid公司；JMTD 168/140面條機 北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半干面的制作工藝流程

小麥粉、食鹽、水(質(zhì)量比100:2:35)→和面(慢速檔攪拌5min，中速檔攪拌2min)→熟化(室溫靜置20min)→壓延(在壓輥間距2、1.8、1.5mm處各對折壓片5次，形成厚度為1.5mm的面片)→部分脫水(115℃烘干4min)→均濕(將面條置于自封袋中室溫靜置3h)→包裝(用PA15/ PE60透明袋包裝，常規(guī)熱封)

1.3.2 半干面的微生物計數(shù)

菌落總數(shù)測定：參照GB/T 4789.2—2008《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[5]；霉菌及酵母菌測定：參照GB/T 4789.15—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數(shù)》[6]；金黃色葡萄球菌測定：參照GB/T 4789.10—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[7]。

1.3.3 腐敗菌的分離純化

從平板計數(shù)瓊脂和孟加拉紅培養(yǎng)基中選取典型生長的單一菌落，平板劃線法反復分離純化，鏡檢，得到純菌株。把純菌株轉(zhuǎn)移接種至斜面培養(yǎng)基，作為鑒定用菌株。

1.3.4 形態(tài)學鑒定

菌落形態(tài)觀察：觀察單菌落的大小、形狀、質(zhì)地、顏色、透明度、邊緣、表面紋飾等。

菌體形態(tài)觀察：挑取細菌24h培養(yǎng)物、霉菌120h培養(yǎng)物制成載片標本，觀察細胞形態(tài)、排列方式等。

1.3.5 生理生化鑒定

生理生化實驗主要包括革蘭氏染色、厭氧生長、氧化酶實驗、接觸酶實驗、淀粉水解實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、耐鹽性實驗、檸檬酸鹽利用實驗、丙酸鹽利用實驗、糖類發(fā)酵實驗等，采用枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為陽性對照(菌株由江南大學食品學院食品與生物技術(shù)研究室提供)。實驗方法參考《一般細菌常用鑒定方法》[8]和《伯杰細菌鑒定手冊》[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 半干面的微生物計數(shù)

由于市售半干面中使用保鮮劑的種類及添加量各有不同，對面條中優(yōu)勢腐敗菌的判斷有一定干擾。因此，本實驗選取了合作工廠所選用的面粉為原料，按照半干面工業(yè)化的生產(chǎn)和包裝條件，制作未添加任何防腐劑的半干面，并對其微生物數(shù)量變化和腐敗菌進行分離鑒定，從而為進一步有針對性地尋找半干面的保鮮措施和保鮮效果評價提供理論依據(jù)。

本實驗室制作的半干面的pH值為6.36，水分含量為24.94%，水分活度為0.917，未添加任何防腐劑，腐敗微生物的生長繁殖非常迅速。在25℃貯藏過程中，半干面的菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌的變化規(guī)律見表1。在貯藏的第3天，菌落總數(shù)達到1.0×106CFU/g，超過了NY/T 1512—2007《綠色食品 生面食、米粉制品》[10]中生面食菌落總數(shù)應≤3×105CFU/g的要求，半干面在25℃條件下的貨架期僅為2d。

表1 25℃貯藏過程中半干面的微生物數(shù)量變化規(guī)律Table 1 The growth of microorganisms in semi-dry noodles during storage at 25 ℃CFU/g

2.2 細菌的分離鑒定

由微生物計數(shù)結(jié)果可知，細菌是半干面中最主要的腐敗菌。從培養(yǎng)基中選取4株典型的細菌進行反復劃線分離，最終分離出4株細菌，分別為B1、B2、S1、S2。經(jīng)革蘭氏染色、芽孢染色、好氧性實驗、接觸酶實驗、葡萄糖發(fā)酵實驗等發(fā)現(xiàn)，B1、B2為革蘭氏陽性桿菌，產(chǎn)芽孢，產(chǎn)接觸酶，初步鑒定為芽孢桿菌科芽孢桿菌屬(Bacillus)的細菌；S1、S2為革蘭氏陽性球菌，無芽孢，菌體直徑0.80～0.95μm，形成不規(guī)則堆團，好氧，發(fā)酵葡萄糖，初步鑒定為微球菌科葡萄球菌屬(Staphylococcus)的細菌。

2.2.1 芽孢桿菌的分離鑒定

表2 芽孢桿菌B1、B2的生理生化特征Table 2 Biochemical properties of B1 and B2

芽孢桿菌B1和B2的生理生化特征見表2。菌株B1在營養(yǎng)瓊脂上的菌落近似圓形，呈奶油色，邊緣呈波狀；菌體長2.0～4.0μm，寬0.7～0.9μm，芽孢中生(圖1-B1)，好氧，產(chǎn)接觸酶，產(chǎn)淀粉酶，能還原硝酸鹽，能利用檸檬酸鹽和丙酸鹽，鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillius subtills)。菌株B2在營養(yǎng)瓊脂上的菌落為不規(guī)則形，呈灰白色，表面粗糙，邊緣毛發(fā)狀；菌體長1.3～2.0μm，寬0.4～0.6μm，芽孢中生，菌體外有糖被(圖1-B2)，產(chǎn)接觸酶，產(chǎn)淀粉酶，明膠液化緩慢，能利用檸檬酸鹽，不利用丙酸鹽，鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillius licheniformis)。

圖1 芽孢桿菌B1、B2在顯微鏡下的菌體形態(tài)(×1000)Fig.1 Micrograph of B1 and B2 (×1000)

芽孢桿菌在自然界中廣泛存在[11]，由于能形成對熱、輻射具有很強抗性的芽孢，因此芽孢桿菌能忍受多種不良環(huán)境。王辛[12]研究發(fā)現(xiàn)，影響糕團保質(zhì)期的主要細菌為好氧性的革蘭氏陽性芽孢桿菌。Rosenkvist等[13]的研究表明，引起面包腐敗的主要細菌是芽孢桿菌屬。在本實驗中，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是半干面貯藏前期(第0天和第1天)的主要腐敗菌。在半干面貯藏后期(第2天和第3天)，隨著葡萄球菌的大量生長繁殖，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌所占比例明顯降低。

2.2.2 葡萄球菌的分離鑒定

表3 葡萄球菌S1、S2的生理生化特征Table 3 Biochemical properties of S1 and S2

葡萄球菌S1和S2的生理生化特征見表3。菌株S1在Baird-Parker(BP)瓊脂上形成黑色、光滑、突起的圓形菌落，無沉淀環(huán)，菌體細胞呈球狀，形成不規(guī)則堆團(圖2-S1)，不產(chǎn)血漿凝固酶，在15%NaCl中可以生長，發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，發(fā)酵阿拉伯糖、纖維二糖、鼠李糖、木糖不產(chǎn)酸，鑒定為表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。菌株S2在BP瓊脂上形成黑色、光滑、突起的圓形菌落，周圍繞以沉淀環(huán)，菌體細胞呈球狀，形成不規(guī)則堆團(圖2-S2)，產(chǎn)血漿凝固酶，在含15% NaCl培養(yǎng)基中可以生長，發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖產(chǎn)酸，發(fā)酵阿拉伯糖、纖維二糖、鼠李糖、木糖不產(chǎn)酸，鑒定為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。

圖2 葡萄球菌S1、S2在顯微鏡下的菌體形態(tài)(×1000)Fig.2 Micrograph of S1 and S2 (×1000)

葡萄球菌在自然界中無處不在，水、空氣、灰塵中均可以找到，可通過食品加工人員、食品原料等多種途徑污染食品。由于葡萄球菌屬中的金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生腸毒素，食后能引起食物中毒，因此，檢查食品中金黃色葡萄球菌有現(xiàn)實意義[14]。徐斐等[15]對糕點、面包類食品的污染細菌進行了初步分離鑒定，認為葡萄球菌是冷加工食品中的主要腐敗菌。Ji Ying等[16]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌是米制松糕中的主要腐敗菌。本實驗中，在半干面貯藏前期，表皮葡萄球菌有少量生長，金黃色葡萄球菌未檢出；貯藏后期，表皮葡萄球菌迅速生長繁殖，成為半干面腐敗中的優(yōu)勢菌群，金黃色葡萄球菌也有少量生長。

2.3 霉菌的分離鑒定

表4 霉菌M1、M2、M3的菌落形態(tài)特征及個體形態(tài)特征描述Table 4 Colony and microstructure characteristics of M1, M2 and M3

圖3 霉菌M1、M2、M3的菌落形態(tài)和個體形態(tài)(×400)Fig.3 Colonial morphology and micrograph of M1, M2 and M3 (×400)

霉變是半干面腐敗的主要現(xiàn)象之一。本實驗對霉菌的鑒定主要依靠形態(tài)學鑒定方法。從培養(yǎng)基中選取3株典型的霉菌M1、M2、M3進行分離培養(yǎng)，其菌落形態(tài)特征和個體形態(tài)見圖3，特征描述見表4。

根據(jù)《真菌鑒定手冊》[17]和GB/T 4789.16—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 常見產(chǎn)毒霉菌的鑒定》[18]，初步鑒定菌株M1為白曲霉(Aspergillus candidus)，菌株M2為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)，菌株M3為圓弧青霉(Penicillum cyclopium)。霉菌在自然界中分布相當廣泛，很容易污染食品。有些霉菌可產(chǎn)生毒素，引起食物中毒和癌癥，應當加以重視。胡慶松等[19]研究發(fā)現(xiàn)，曲霉是年糕中的主要腐敗霉菌。陳盼[20]從市售月餅中分離出9種霉菌，其中大部分是曲霉。本實驗中，白曲霉是引起半干面腐敗的主要霉菌，占霉菌總數(shù)的50%以上。白曲霉在自然界中分布廣泛，主要來自土壤、食品和貯存的谷物，是糧食中重要的“貯藏真菌”。因此，本實驗分析認為半干面中的白曲霉主要來源于原料面粉中。雜色曲霉和圓弧青霉在半干面中的檢出率相對較低，但是雜色曲霉能產(chǎn)生雜色曲霉素，圓弧青霉能產(chǎn)生圓弧偶氮酸，二者分別能引起肝、腎的損害和神經(jīng)的損害。

3 結(jié)論與討論

導致半干面腐敗的微生物主要是細菌，其次是霉菌，酵母菌較少。本實驗主要分離和鑒定出7株典型菌株，即枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、雜色曲霉、圓弧青霉。其中，曲霉是主要的腐敗霉菌，占霉菌總數(shù)的50%以上。芽孢桿菌是半干面貯藏前期的主要腐敗細菌，在半干面貯藏后期，葡萄球菌生長繁殖迅速，成為最主要的腐敗細菌。實驗前期，曾以江蘇地區(qū)不同半干面廠家的3種小麥粉為原料，制作半干面，并對其中的腐敗菌進行了初步的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)面條中的優(yōu)勢菌始終是G＋細菌，且以芽孢桿菌和球菌為主。因此，在半干面的生產(chǎn)過程中，可以針對性地采取一些保鮮措施來控制腐敗微生物的生長繁殖。適度提高烘干溫度將能進一步降低半干面腐敗前期葡萄球菌的數(shù)量。丙酸鈣是GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》[21]中允許應用于生濕面制品的化學防腐劑，在降低半干面pH值的基礎(chǔ)上，結(jié)合使用丙酸鈣，能有效抑制霉菌和芽孢桿菌的生長。一些天然保鮮劑，如茶多酚[22]、殼聚糖[23]等，對革蘭氏陽性細菌都具有很強的抑菌活性。此外，酒精緩釋劑也正日益成為一種成熟的保鮮技術(shù)[24]，氣體酒精對半干面中的芽孢桿菌、葡萄球菌和霉菌都能起到很強的抑制作用，達到延長半干面貨架期的效果。

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Isolation and Identification of Spoilage Microorganisms of Semi-dry Noodles

LI Jie，SUN Shu，ZHU Ke-xue*，PENG Wei，ZHOU Hui-ming
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective: To explore the major spoilage microorganisms in semi-dry noodles and to provide theoretical basis of preservation. Methods: The major microorganisms in semi-dry noodles were isolated and identified by means of morphological and biochemical tests. Results: The dominant spoilage microorganisms wereBacillusandStaphylococcus. The isolated bacteria strains wereBacillus subtills,B. licheniformis,Staphylococcus epidermidisandS. aureus. The isolated mould strains belonged to the species ofAspergillus candidus,A. versicolorandPenicillum cyclopium. During the first 2 days, species ofB. subtillsandB. licheniformiswere dominant. After 2 days of storage,S. epidermidisbecame the dominant bacteria in the semi-dry noodles andS. aureuswas also detected.

semi-dry noodles；spoilage microorganism；isolation；identification

TS213.2；TS201.3

A

1002-6630(2012)05-0183-05

2011-03-12

李潔(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：lijie0511409@163.com

*通信作者：朱科學(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為方便食品及品質(zhì)改良。E-mail：kxzhu@jiangnan.edu.cn