趙 輝，敞 顏，王 葳，凌宏志，平文祥，趙志昌，楊朝輝

(1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；3.黑龍江省富裕老窖酒業(yè)有限公司，黑龍江 富裕 161200)

濃香型白酒窖泥中高產(chǎn)己酸兼性厭氧細(xì)菌的分離鑒定

趙 輝1,2，敞 顏1,2，王 葳1,2，凌宏志1,2，平文祥1,2，趙志昌3，楊朝輝3

(1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500；3.黑龍江省富裕老窖酒業(yè)有限公司，黑龍江 富裕 161200)

篩選及鑒定白酒窖泥中高產(chǎn)己酸的細(xì)菌，以應(yīng)用于窖池保養(yǎng)及人工窖泥培養(yǎng)。從東北地區(qū)某酒廠優(yōu)質(zhì)窖泥中采用兼性厭氧培養(yǎng)及微量成分分析的方法，分離篩選出3株(C78、a57、A17)高產(chǎn)己酸的兼性厭氧細(xì)菌，其產(chǎn)己酸量分別為：213.6914、170.465、103.5097mg/100mL，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定其分別為：巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformis)及地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，相應(yīng)最適pH值分別為7、6.5、7，最適溫度分別為34、34、37℃，最適接種量分別為5%、5%、3%。

濃香型白酒；窖泥；產(chǎn)己酸細(xì)菌；鑒定

白酒是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，因其獨(dú)特的釀造工藝及其呈現(xiàn)的特殊風(fēng)味，在世界酒類產(chǎn)品中別具一格。白酒種類繁多，分類各異。根據(jù)主體香成分的不同，可分為濃香型、醬香型、清香型、兼香型、鳳香型、藥香型和米香型等十幾種香型。目前，濃香型白酒是白酒行業(yè)的主流，其產(chǎn)銷量占白酒總產(chǎn)銷量的70%[1]。在傳統(tǒng)固態(tài)濃香型白酒發(fā)酵中，窖泥是白酒風(fēng)味的基礎(chǔ)，長(zhǎng)期的工藝操作使窖泥富集了種類繁多、功能各異的益于釀酒的微生物菌群[2-9]。己酸菌是其中最重要的窖泥功能菌，其數(shù)量的多少以及其功能的強(qiáng)弱直接影響著濃香型大曲酒中特征風(fēng)味物質(zhì)的形成。己酸菌所產(chǎn)生的己酸在白酒中不僅起到呈香、助香、減少酒體刺激以及緩沖平衡的作用，而且還可以與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，生成濃香型大曲酒的主體香成分己酸乙酯，從而改善濃香型白酒的風(fēng)味及口感。己酸產(chǎn)生細(xì)菌可應(yīng)用于窖池保養(yǎng)以及人工窖泥培養(yǎng)等，可有效改善窖泥微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而提高濃香型白酒的質(zhì)量，對(duì)名優(yōu)白酒生產(chǎn)的異地再現(xiàn)有著積極的意義[10-12]。

對(duì)產(chǎn)己酸菌的分離、篩選、分類、鑒定以及選育，是提高窖泥中己酸菌數(shù)量和質(zhì)量的保證[13-16]。產(chǎn)己酸的細(xì)菌包括兼性厭氧和厭氧菌兩大類，篩選兼性厭氧細(xì)菌可以降低己酸菌在窖泥使用過程中的應(yīng)用成本，具有更高的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用非厭氧培養(yǎng)條件從優(yōu)質(zhì)窖泥中分離、純化、篩選出高產(chǎn)己酸的兼性厭氧功能細(xì)菌，并進(jìn)行生理生化及分子生物學(xué)鑒定，以期為使用人工窖泥擴(kuò)大窖池內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群、改善窖內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、提高濃香型白酒質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

窖泥：取自某酒廠優(yōu)質(zhì)濃香型大曲酒發(fā)酵池。

分離和保藏培養(yǎng)基：5g乙酸鈉、0.5g硫酸銨、0.4g磷酸氫二鉀、0.2g硫酸鎂、1g酵母膏、20mL乙醇(培養(yǎng)基滅菌后接種前加入)、5g碳酸鈣、10mL 0.1%溴百里酚藍(lán)指示劑、15～20g瓊脂，加水至1000mL，調(diào)pH值為7.0，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：5g蛋白胨、5g牛肉膏、25g葡萄糖、5g NaCl，1000mL蒸餾水，pH7.0，121℃滅菌20min。

細(xì)菌基因組、質(zhì)粒提取及DNA純化回收試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司；正反向引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；pMD19-T載體、DNA聚合酶、DNA Marker、PCR產(chǎn)物克隆試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司；乙酸丁酯、乙酸、丁酸、己酸、丁酸乙酯、己酸乙酯為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CF16RXII 高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；UV755B紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Tprofessional Thermocycler PCR儀 德國(guó)Biometra公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；GC7890氣相色譜儀 上海天美科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 高產(chǎn)己酸細(xì)菌的篩選

稱取窖泥1g，放入盛有99mL無(wú)菌水且含有無(wú)菌玻璃珠的三角燒瓶中，用力振蕩，使窖泥分散均勻，80℃水浴加熱10min，淘汰非芽孢細(xì)菌，富集含芽孢優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[17]。

吸取富集菌液1mL，將10-1～10-6梯度的稀釋菌懸液分別涂布于篩選培養(yǎng)基(含有溴百里酚藍(lán)指示劑)上，每個(gè)梯度做3個(gè)平行樣，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)24h，篩選出黃色菌落，根據(jù)其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)的不同將其簡(jiǎn)單歸類，并進(jìn)行純化保藏。

1.3.2 高產(chǎn)己酸細(xì)菌的復(fù)篩

分離純化出的菌株活化后，分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行單菌種發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定總酸、總酯含量，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行己酸的定性分析，對(duì)含己酸的發(fā)酵液再利用氣相色譜法測(cè)定其己酸及重要香味成分的產(chǎn)量，復(fù)篩出高產(chǎn)己酸的功能細(xì)菌[18-20]。

1.3.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

篩選出的高產(chǎn)己酸細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定方法參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[22]。生理生化鑒定包括氧對(duì)菌株的影響、接觸酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)(M.R.實(shí)驗(yàn))、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠液化、石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)、脲酶實(shí)驗(yàn)等生理生化實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次且設(shè)有陰性和陽(yáng)性對(duì)照[23-24]。

1.3.4 篩選菌株的16S rDNA鑒定

1.3.4.1 提取細(xì)菌基因組DNA

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA。

1.3.4.2 PCR擴(kuò)增16S rDNA序列片段及克隆

以己酸產(chǎn)生細(xì)菌的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：正向引物8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1512R：5′-ACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液 2.5μL，dNTP 2μL，正向引物與反向引物各1μL，DNA模板1μL，滅菌水17.3μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，總計(jì)25μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10min；94℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min，4℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，并使用DNA純化回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化及回收。使用TaKaRa連接試劑盒，將純化后的目的片段連接至pMD19-T 載體上，目的片段與載體連接反應(yīng)體系如表1所示?；旌暇鶆蚝?，4℃靜置過夜。連接結(jié)束后，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白篩選。

對(duì)重組陽(yáng)性質(zhì)粒保存并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證克隆結(jié)果。

表1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后的目的片段與載體連接反應(yīng)體系Table 1 Coupled reaction system(10μL)

1.3.4.3 16S rDNA片段的測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析

序列測(cè)定由上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。將測(cè)序所得到的16S rDNA全序列提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，并應(yīng)用Blast軟件進(jìn)行同源性搜索、比對(duì)分析，再應(yīng)用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[25-26]。

1.3.5 篩選菌株培養(yǎng)條件的研究

設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值梯度為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；培養(yǎng)溫度的梯度為28、31、35、37、40℃；接種量的梯度為2%、3%、4%、5%、6%，將種子液接種于培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。培養(yǎng)后梯度稀釋涂平板，計(jì)算菌液濃度，重復(fù)3次，分別確定培養(yǎng)的最適pH值、溫度和接種量。

1.3.6 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.3.6.1 發(fā)酵液總酸、總酯產(chǎn)量的測(cè)定

總酸產(chǎn)量測(cè)定采用電位滴定法，總酯產(chǎn)量測(cè)定采用皂化法[25]。

1.3.6.2 己酸的定性分析

用移液管吸取1.5mL發(fā)酵液，緩慢沿壁滴加到含有5mL 20% CuSO4溶液的試管中，靜置10min后觀察CuSO4溶液中是否有藍(lán)色絮狀沉淀產(chǎn)生。若有，則說(shuō)明發(fā)酵液中有己酸生成，否則說(shuō)明沒有[26]。

1.3.6.3 己酸等主要代謝產(chǎn)物測(cè)定

采用氣相色譜法，用直徑為0.22μm的過濾器對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾，得到澄清透明溶液。以乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)，待測(cè)樣品進(jìn)樣量為0.3μL。氣相色譜法分析條件：用PEG2.0×107(聚乙二醇)毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)，氫火焰離子檢測(cè)器，柱溫采取程序升溫：初始溫度為65℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升溫，升至 200℃時(shí)保持10min。進(jìn)樣器溫度為260℃，檢測(cè)器溫度為260℃，載氣(高純氮?dú)?流速：0.5～1.0mL/min，分流比20:1～100:1。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)己酸細(xì)菌的分離篩選

通過篩選培養(yǎng)基篩選出黃色或黃綠色菌落為產(chǎn)酸菌。對(duì)其進(jìn)行菌落形態(tài)描述和顯微形態(tài)觀察，共篩選出了18株不同的細(xì)菌，將產(chǎn)酸菌菌落進(jìn)行純化、保存，并對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)總酸、總酯產(chǎn)量分析、CuSO4顯色法己酸定性分析和氣相色譜分析。其中篩選得到的3株細(xì)菌，產(chǎn)總酸、總酯產(chǎn)量較高，結(jié)果如表2所示，CuSO4顯色己酸定性分析表明皆含有己酸，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行氣相色譜對(duì)酸、酯微量成分分析，結(jié)果見表3。

表2 發(fā)酵液中總酸、總酯產(chǎn)量Table 2 The contents of total acids and total esters in fermentation liquid

表3 發(fā)酵液中酸、酯微量成分氣相色譜分析Table 3 Gas chromatographic analysis of fermentation liquid compositions

由表3可知，C78產(chǎn)己酸量最高，達(dá)到213.6914mg/ 100mL，a57次之，產(chǎn)量為170.465mg/100mL，A17己酸產(chǎn)量雖為103.5097mg/100mL，但A17發(fā)酵液中的乙酸、丁酸以及丁酸乙酯等酒體呈香、呈味物質(zhì)的含量在18株菌株發(fā)酵液中均較高。綜合考慮，以己酸產(chǎn)量為主、其他呈香、呈味物質(zhì)為輔復(fù)篩出了3株高產(chǎn)己酸的優(yōu)良功能菌株a57、A17、C78。

表4 細(xì)菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Table 4 Colonial and microscopic characteristics of the isolated strains

2.2 篩選菌株的鑒定

2.2.1 篩選菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

篩選出的3株高產(chǎn)己酸細(xì)菌a57、A17、C78菌落形態(tài)觀察、顯微形態(tài)觀察如表4所示。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。初步確定菌株a57、A17、C78均為芽孢桿菌屬(Bacillus cohn)。

表5 菌株生理生化特性Table 5 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strains

圖1 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis for 16S rDNA PCR amplified products

利用細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)菌株a57、A17、C78的培養(yǎng)液進(jìn)行基因組DNA的提取。將提取基因組DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。凝膠成像系統(tǒng)可以看到單一、清晰且整齊的條帶，表明所提取基因組DNA樣品無(wú)降解、較完整。獲得功能菌株a57、A17、C78基因組DNA后，用細(xì)菌通用引物對(duì)其進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳，得到特異單一條帶，結(jié)果如圖1所示， a57、 A17、 C78與預(yù)計(jì)條帶大小1600bp吻合。

將PCR擴(kuò)增16S rDNA目的片段與pMD19-T Vector連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，進(jìn)行藍(lán)白篩選。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其電泳結(jié)果如圖2所示，目的片段轉(zhuǎn)化成功，得到了陽(yáng)性克隆。

將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，菌株a57、A17、C78 16S rDNA測(cè)序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中利用Blast進(jìn)行比對(duì)分

注：＋.陽(yáng)性反應(yīng)；－.陰性反應(yīng)；－(+).不產(chǎn)氣或弱產(chǎn)氣。

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析析，分析顯示菌株a57與Bacillus fusiformisstrain Z1相似性最高，達(dá)99%，序列號(hào)為AY548950；菌株A17與Bacillus licheniformisstrain B8相似性最高，達(dá)99%，序列號(hào)為EU117278；菌株C18與Bacillus megateriumstrain SB3112相似性最高，達(dá)99%，序列號(hào)為GU191918。利用DNAMAN軟件繪制菌株a57、A17、C78的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示。結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化分析，可以確定菌株a57為梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformis)，A17為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，C78為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)。

圖2 重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of recombinant plasmids

圖3 基于菌株a57(a)、A17(b)、C78(c) 16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain a57(a), A17(b) and C78(c) based on 16S rDNA gene sequence

2.3 篩選菌株培養(yǎng)條件的結(jié)果

圖4 pH值(a)、溫度(b)、接種量(c)對(duì)菌體濃度的影響Fig.4 Effect of pH (a), temperature (b) and inoculum size (c) on the concentration of bacteria

由圖4a可知，A17和C78的最適pH值為7，a57的最適pH值為6.5；由圖4b可知，a57和C78的最適溫度為34℃，A17的最適溫度為37℃；由圖4c可知，A17最適接種量為3%，a57和C78的最適接種量為5%；此時(shí)相應(yīng)培養(yǎng)的菌體濃度均達(dá)到最大。實(shí)際應(yīng)用時(shí)，可在最適條件下進(jìn)行單獨(dú)或混合培養(yǎng)，在菌體濃度較高時(shí)，制成液體窖泥噴灑于濃香型酒窖的窖底和四壁，增加窖泥中己酸細(xì)菌的濃度，以促進(jìn)白酒發(fā)酵生香；亦可單獨(dú)或混合接種于酒窖外人工培養(yǎng)的固體窖泥，增加窖泥中產(chǎn)香功能菌的濃度。

3 結(jié)論與討論

從某濃香型大曲酒廠優(yōu)質(zhì)窖泥中進(jìn)行兼性厭氧己酸細(xì)菌的分離篩選，得到3株高產(chǎn)己酸的功能細(xì)菌A17、 a57及C78，經(jīng)氣相色譜法對(duì)其發(fā)酵液中己酸產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)量分別為103.5097、170.465、213.6914mg/100mL。通過菌落形態(tài)、細(xì)胞顯微形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)手段對(duì)菌株a57、A17及C78進(jìn)行鑒定，其結(jié)果分別為：梭狀芽孢桿菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步研究，為高效人工窖泥的應(yīng)用提供參考。

提高濃香型白酒的質(zhì)量，需要適當(dāng)?shù)靥岣甙拙浦屑核嵋阴サ漠a(chǎn)量，也就要保證窖泥中己酸菌等功能菌的數(shù)量。在白酒生產(chǎn)中，窖泥使用一段時(shí)間后會(huì)老化，己酸菌等功能菌數(shù)量大量減少，嚴(yán)重影響著白酒的質(zhì)量及優(yōu)級(jí)品率。為防止窖泥老化、縮短新窖老熟時(shí)間，就需要進(jìn)行窖泥養(yǎng)護(hù)和人工窖泥培養(yǎng)等方面的研究[27-28]。本實(shí)驗(yàn)采取非厭氧培養(yǎng)的方法分離得到了3株高產(chǎn)己酸的兼性厭氧細(xì)菌，與厭氧己酸細(xì)菌Clostridium kluyverii相比[29]，更易于實(shí)現(xiàn)窖外窖泥的養(yǎng)護(hù)和人工窖泥的培養(yǎng)，可提高窖泥培養(yǎng)效果，節(jié)約培養(yǎng)成本，并且Bacillus fusiformis、Bacillus licheniformis和Bacillus megaterium已廣泛作為酶及食品添加劑工業(yè)的發(fā)酵菌種，具有較高的生物安全性。

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Isolation and Identification of Facultative Anaerobic Strains with High Yield of Hexanoic Acid from Luzhou-flavor Liquor Pit Mud

ZHAO Hui1,2，CHANG Yan1,2，WANG Wei1,2，LING Hong-zhi1,2，PING Wen-xiang1,2，ZHAO Zhi-chang3，YANG Zhao-hui3
(1. College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China；2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Harbin 150500, China；3. Heilongjiang Fuyulaojiao Brewery Co. Ltd., Fuyu 161200, China)

In order to screen and identify hexanoic acid-producing anaerobic bacteria with high yield from liquor pit mud and to apply it in maintaining pits or artificial pit mud. The hexanoic acid-producing anaerobic strains with high yield were isolated and selected from the fine pit mud of the distillery in the northeast area by facultative anaerobic culture and trace component analysis. The yields of hexanoic acid were up to 213.6914, 170.465 mg/100 mL and 103.5097 mg/100 mL, respectively. The species identification showed that three strains wereBacillus fusiformis,Bacillus licheniformis andBacillus megaterium, respectively, through morphological observation, physiological and biochemical tests and molecular biology methods. The optimal pH was 7, 6.5 and 7 and the optimal temperatures were 34, 34 ℃ and 37 ℃ as well as the optimal inoculums were 5%, 5% and 3%. This study provides a theatrical guidance for the application of efficiently artificial pit mud.

Luzhou-flavor liquor；pit mud；hexanoic acid-producing bacteria；identification

Q815

A

1002-6630(2012)05-0177-06

2011-09-28

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才專項(xiàng)基金項(xiàng)目(2011RFQXN056)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12511409)

趙輝(1971—)，男，副教授，博士后，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：zhaohui9463@sohu.com