劉振春，郭 炫，楊童奧，梁國朋，吳 偉*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

填飼對(duì)鵝肥肝脂肪酸合成酶基因mRNA表達(dá)的影響

劉振春，郭 炫，楊童奧，梁國朋，吳 偉*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118)

以朗德鵝為對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究不同填飼周齡脂肪酸合成酶基因(FAS基因)表達(dá)的規(guī)律性。結(jié)果顯示，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量(FAS與β-actin基因表達(dá)量的比值)在填飼前、填飼1周、填飼2周、填飼3周和填飼4周相對(duì)表達(dá)量逐漸增高，分別為0.035、0.128、0.253、0.876、1.009，說明肥肝組織中FAS基因表達(dá)豐度與填飼期呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)AS基因在鵝肥肝形成過程及體脂沉積過程中具有一定的調(diào)控作用，為促進(jìn)鵝肝內(nèi)脂肪沉積的主要調(diào)控基因。

填飼；鵝肥肝；脂肪酸合成酶；基因表達(dá)

鵝肥肝主要是指朗德鵝生長發(fā)育基本完成后，在短期內(nèi)(2～3周)人工對(duì)生長發(fā)育至一定體質(zhì)量(一般為4.5kg左右)的鵝進(jìn)行強(qiáng)制填喂過量玉米或糙米等高能量的碳水化合物飼料，使這些飼料通過鵝機(jī)體正常的新陳代謝，轉(zhuǎn)化為甘油三酯(TG)并在肝臟內(nèi)貯存而獲得比正常鵝肝重5～10倍的脂肪肝[1]，它是一種高檔的新型家禽產(chǎn)品。鵝肥肝并不影響鵝的正常身體代謝，法國Grassey教授精辟地指出：“禽類吃了含多種糖分和大量淀粉的飼料后，生成沉積于皮下、腹腔和肝臟中的脂肪，這種脂肪的出現(xiàn)是一種正常狀態(tài)，就像豬在皮下沉積脂肪是一個(gè)機(jī)理”。大量的脂肪沉積在鵝肥肝中，在質(zhì)量和生理理化性狀兩方面都和超期飼養(yǎng)前鵝的普通肝有很大差異，因此鵝肥肝和鵝肝的概念是完全不同的。鵝肥肝含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、卵磷脂、甘油三酯、各種酶、核糖核酸、脫氧核糖核酸和多種微量元素等營養(yǎng)成分[2]。經(jīng)填飼后的肥鵝肝，其營養(yǎng)成分發(fā)生了顯著變化，脂肪含量高達(dá)60%～70%左右，是正常肝的7～12倍；不飽和脂肪酸比動(dòng)物油中含脂肪較高的豬油還要高11%以上，比正常肝相對(duì)含量增加20倍；卵磷脂增加4倍；酶活性增加3倍；核糖核酸和脫氧核糖核酸增加1倍[3-4]。每100g肥肝中卵磷脂含量高達(dá)4.5～7g，脫氧核糖酸和核糖核酸含量達(dá)9～13.5g。

“卵磷脂”是當(dāng)今國際市場保健藥物和食品中必不可少的重要成分，具有降低血脂，軟化血管，延緩衰老，防治心腦血管疾病發(fā)生的功效；而亞油酸為人體所必需，且在人體內(nèi)不能合成，必須由食物中攝取，可降低人體血液中膽固醇的含量[5-6]。鵝肥肝與普通鵝肝相比，有效營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)氧化后產(chǎn)生的熱量增加10倍[7]，極大地提高了它的營養(yǎng)價(jià)值和食療價(jià)值[8]。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量法測定鵝肥肝中脂肪酸合成酶基因(FAS基因) mRNA表達(dá)豐度變化規(guī)律，以驗(yàn)證FAS基因是鵝肥肝形成過程中關(guān)鍵調(diào)控基因，旨在為今后鵝肥肝填飼提供有價(jià)值的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

選取由吉林省9臺(tái)順達(dá)鵝業(yè)有限公司的同批孵化和在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下統(tǒng)一飼養(yǎng)的健康朗德鵝132只，體質(zhì)量4.5kg，10周齡，并進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，填飼28d。每個(gè)填飼階段結(jié)束后，隨機(jī)抽取20只宰殺，迅速取肝臟10g左右，放入10mL凍存管中快速置入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后盡快提取RNA，以免其降解。

1.2 試劑與儀器

焦碳酸二乙酯(DEPC) 美國Sigma公司；Trizol試劑 美國Invitrogen公司；氯仿 天津化學(xué)試劑有限公司；異丙醇 北京化工廠；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本TaKaRa公司；DNA Marker DL2000 天為時(shí)代生物有限公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；小劑量快速質(zhì)粒DNA提取試劑盒 美國Omega公司。

超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；核酸濃度測定儀 英國Pharmacia Biotech公司；ABI System 7000型熒光定量PCR儀 美國ABI公司；－80℃超低溫冰箱 日本Sanyo公司；低溫高速離心機(jī) 美國Sigma公司。

1.3 總RNA提取

采用Trizol一步法，用于總RNA提取的塑料器皿、耗材均經(jīng)過0.1% DEPC處理，玻璃器皿于180℃干烤8h以上。具體操作步驟參照說明書。

將2μL RNA溶液加入198μL的0.1% DEPC處理的水中，以DEPC處理水為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測定其在波長260nm處的光密度值(OD260nm)以及波長260nm與波長280nm處OD值的比值(OD260nm/OD280nm)及總RNA濃度。

1.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶，以提取的鵝肥肝總RNA為模板，以O(shè)ligo-dT為引物(工作濃度為10pmol/μL)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.5 PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中原雞的FAS(NM_205155.1)和β-actin(L08165.1)的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，詳見表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)所用引物Table 1 Primers of RT-PCR

運(yùn)用常規(guī)PCR法，用內(nèi)參引物以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證cDNA的完整性。然后擴(kuò)增目的片段，得到的PCR產(chǎn)物可以用于制備熒光定量PCR的陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 PCR回收

采用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物目的片段，目的片段DNA溶液于－20℃保存。

1.7 目的片段克隆與測序

將凝膠回收的目的DNA片段連接到pMD-18T載體上，用CaCl2法制備E.coliDH5α感受態(tài)宿主菌(在嚴(yán)格的無菌條件下制備感受態(tài))，分別擴(kuò)增128bp和316bp的目的片段和81bp的內(nèi)參片段，將PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海Sangon公司進(jìn)行序列測定。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將質(zhì)粒溶液用純水進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋到1×109、1×108、1×107、1×106、1×105copies/μL，即為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)品的5個(gè)水平，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)，3個(gè)陰性對(duì)照。加樣過程中，要確保相同處理各管反應(yīng)液的均一性，且確保各管加樣量一致。另外還需注意防止96孔反應(yīng)板上各管的交叉污染。

設(shè)置熒光定量PCR儀程序。與探針法不同的是，染料法需要附加一個(gè)溶解曲線制作反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝肥肝中總RNA的提取

所提取的RNA樣品用分光光度計(jì)測定，所有的RNA樣品OD260nm/OD280nm值均在1.8～2.1之間，總RNA電泳圖有清晰的28S、18S條帶(圖1)，表明所提取總RNA完整性較好，無降解，RNA質(zhì)量符合RT-PCR實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 鵝肥肝總RNA電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of total RNA from tissues

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的靈敏性

以梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為陽性模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增曲線見圖2、3。

圖2 FAS基因擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.2 Correlation between cycle number of FAS gene amplification and fluorescence intensity

圖3 β-actin基因擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.3 Correlation between cycle number of β-actin gene amplification and fluorescence intensity

由圖2、3可知，不同拷貝數(shù)的檢測范圍較廣，循環(huán)閾值(Ct)范圍在13～35，擴(kuò)增前期曲線重合性好且無雜峰，呈典型S型熒光定量學(xué)曲線，是理想的擴(kuò)增曲線，說明實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測FAS基因具有較好的敏感性，反映出樣品擴(kuò)增效率較好。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線和假陽性曲線

以不同拷貝數(shù)陽性標(biāo)準(zhǔn)品模板的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光定量PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始Ct為縱坐標(biāo)繪制FAS基因和β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中熒光信號(hào)的初始Ct是指圖中不同拷貝數(shù)的模板與虛線相交處的循環(huán)數(shù)。FAS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝－3.588x＋14.447(R2＝0.994)，擴(kuò)增效率為90.0%；β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝－3.684x＋14.067(R2＝0.994)，擴(kuò)增效率為86.8%；說明實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增效果好，具有較高的可靠性。

陽性模板在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的后期，產(chǎn)物經(jīng)熔融、冷卻得到溶解曲線。其中橫坐標(biāo)代表熒光值(－d(RFU)/dT)，縱坐標(biāo)代表溫度，見圖4、5。

圖4 FAS基因擴(kuò)增溶解曲線Fig.4 Dissociation curve of FAS gene amplified product

圖5 β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線Fig.5 Dissociation curve of β-actin gene amplification product

由圖4、5可知，溶解曲線成單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。

2.4 填飼不同周齡FAS基因表達(dá)規(guī)律

采用相對(duì)定量，即FAS和β-actin熒光定量的比值(FAS/β-actin比值)來表示。FAS和β-actin熒光定量的比值測定結(jié)果見表2。填飼前、填飼不同周齡，鵝肥肝組織中FASmRNA表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)。填飼前與填飼1周差異不顯著(P＞0.05)，填飼3周、填飼4周與填飼1周FAS基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量差異顯著(P＜0.05)。

由表3方差分析結(jié)果可以看出，不同填飼周齡鵝肥肝中FAS基因相對(duì)表達(dá)量逐漸增加。填飼前FAS基因相對(duì)表達(dá)量很低，僅為0.035±0.032，此時(shí)對(duì)應(yīng)的肝質(zhì)量為(105±31)g；填飼1周FAS基因相對(duì)表達(dá)量為0.128± 0.031，肝質(zhì)量為(242±40)g，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量增加了0.093，肝質(zhì)量增加了137g；填飼2周FAS基因相對(duì)表達(dá)量為0.253±0.049，肝質(zhì)量(467±163)g，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量增加了0.125，肝質(zhì)量增加了225g；填飼3周FAS基因相對(duì)表達(dá)量為0.876±0.162，肝質(zhì)量(805± 181)g，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量增加了0.623，肝質(zhì)量增加了338g；填飼4周FAS基因相對(duì)表達(dá)量為1.009±0.435，肝質(zhì)量(995±220)g，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量增加了0.133，肝質(zhì)量增加了190g。表明FAS基因相對(duì)表達(dá)量在填飼第3周時(shí)增加迅速，肝質(zhì)量增加量也大，而填飼第4周，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量增加少，肝質(zhì)量增加也隨之減少。

根據(jù)表3結(jié)果，對(duì)FAS基因相對(duì)表達(dá)量(y)與填飼周齡(x)進(jìn)行似合，得線性回歸方程為：y＝0.2696x－0.2138(R2＝0.8994)，說明FAS基因相對(duì)表達(dá)量與填飼不同周齡呈正相關(guān)，填飼周齡越長，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量越高，但后期(填飼4周)增加不顯著。量不斷增加，增加趨勢與肝質(zhì)量增加速度基本一致，特別在填飼第3周時(shí)FAS基因相對(duì)表達(dá)量增加達(dá)到最高值，此時(shí)肝質(zhì)量增加也達(dá)最高值338g，鵝肥肝質(zhì)量也超過750g，隨后FAS基因相對(duì)表達(dá)量趨于平穩(wěn)，肝質(zhì)量增加緩慢，說明填飼前期(1～3周)脂肪主要沉積在肝內(nèi)，填飼超過21d脂肪就會(huì)向肝外組織轉(zhuǎn)移。同時(shí)隨著填飼量和填飼次數(shù)的增加，F(xiàn)AS基因在填飼不同周齡的相對(duì)表達(dá)量也逐漸升高，脂肪在肝內(nèi)外的沉積量也隨之增加，從而表明填飼對(duì)基因FAS的表達(dá)影響及其對(duì)鵝肥肝增重的作用是非常顯著的。但Nogalska等[9]研究表明，不同日齡豬腹脂F(xiàn)AS基因表達(dá)量隨日齡增大呈逐漸增加的趨勢。

表3 不同填飼期FAS基因的相對(duì)表達(dá)量測定結(jié)果Table 3 Expression of FAS/β-actin in different feeding periods

3.2FAS基因?qū)Z肥肝脂肪形成的調(diào)控作用

熒光定量PCR結(jié)果顯示FAS基因相對(duì)表達(dá)量在填飼前，填飼1～4周逐漸增高，分別為0.035、0.128、0.253、0.876、1.009。FAS基因相對(duì)表達(dá)量與填飼期顯著正相關(guān)(R2＝0.8994，P＝0.037＜0.05)。Badger 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雞肝FAS豐度越高越能顯著提高體內(nèi)TG的沉積，其活性與肝臟中脂肪的合成與體脂沉積呈正相關(guān)。劉濤[11]研究表明，綿羊尾部脂肪組織中的FAS基因表達(dá)豐度與體質(zhì)量呈顯著正相關(guān)。Reiter等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，豬肝臟組織中FASmRNA表達(dá)豐度與體脂肪含量呈正相關(guān)，這與本研究結(jié)果相一致，表明FAS基因是鵝肝脂肪沉積的主要調(diào)控基因，其表達(dá)量的高低直接影響脂肪在肝內(nèi)外的沉積量。

3 討論與結(jié)論

3.1 鵝肥肝組織中FASmRNA表達(dá)量與產(chǎn)肝性能的相關(guān)性分析

本研究得出，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)量與鵝肥肝質(zhì)量呈正相關(guān)。填飼前FAS基因表達(dá)量很低，鵝肝質(zhì)量只有(105±31)g，隨飼喂周齡不斷延長，F(xiàn)AS基因相對(duì)表達(dá)

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Effect of Feeding Period on Expression ofFASmRNA in Fatty Liver of Goose

LIU Zhen-chun，GUO Xuan，YANG Tong-ao，LIANG Guo-peng，WU Wei*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Landes geese were used as the materials to explore the expression rule ofFASmRNA in fatty liver through real-time fluorescence quantitative PCR method during overfeeding weeks. Fluorescence quantitative PCR results showed that the expression ofFASgene revealed an obvious increase during pre-feeding fold and pro-feeding 1 week, feeding 2 weeks, feeding 3 weeks and feeding 4 weeks, which were 0.035, 0.128, 0.253, 0.876 fold and 1.009 fold enhancement, respectively. A positive genetic correlation betweenFASmRNA expression in fatty liver tissue and feeding weeks was observed. These results suggested thatFASgene had a certain readjustment function during the developing process of fatty liver in goose and the process of body fat deposition. Thus,FASis a regulation gene to promote fat deposit inside liver of goose, which provides valuable technical parameters for future studies of fatty liver.

feeding；fatty liver of goose；fatty acid synthase；gene expression

TS251.1

A

1002-6630(2012)05-0165-05

2011-04-07

吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2009026)

劉振春(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與功能性食品。E-mail：liuzhenchun63@163.com

*通信作者：吳偉(1955—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營養(yǎng)與種性。E-mail：jilinww@yahoo.com.cn