趙 培，王雪青*，陳慶森，彭博麗，亢 凱，陳 歡

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134)

Zn2+對球等鞭金藻3011 細胞膜電位和膜通透性的影響

趙 培，王雪青*，陳慶森，彭博麗，亢 凱，陳 歡

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134)

目的：用親脂性陰離子熒光染料雙(1,3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛爾和碘化丙啶標(biāo)記球等鞭金藻3011 (Isochrysis galbana3011)，研究Isochrysis galbana3011受Zn2+作用時膜電位和膜通透性的變化。方法：對處理藻液進行流式細胞技術(shù)檢測和熒光顯微鏡鏡檢，通過對比實驗設(shè)計，實驗數(shù)據(jù)使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。結(jié)果：5μg/L Zn2+作用4min可使Isochrysis galbana3011細胞內(nèi)熒光強度明顯增強，并促使膜的通透性發(fā)生劇烈變化，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：找到一種快速動態(tài)測定Isochrysis galbana3011細胞膜狀態(tài)的方法，發(fā)現(xiàn)5μg/L的Zn2+能引起Isochrysis galbana3011細胞膜的部分去極化，并改變膜的通透性，Zn2+的吸收有可能與鈉通道聯(lián)動有關(guān)。

球等鞭金藻3011；鋅離子；流式細胞技術(shù)；膜電位；膜通透性

鋅是生物體所必需的一種生命元素，作為50余種酶類約300種酶的輔助因子，參與蛋白質(zhì)[1]、核苷酸、糖以及脂類的代謝，同時在基因轉(zhuǎn)錄、免疫調(diào)節(jié)[2]、細胞生長[3-4]、成熟、分化過程也扮演重要的角色[5]。適當(dāng)?shù)膭┝靠梢蕴岣呙傅谋磉_量，調(diào)節(jié)生長因子的活性[6]，促進細胞生長[7]。Tandogan等[8]也曾經(jīng)觀察到Zn2+的存在對細胞中G6PDH酶有激活作用，但只限于一定的濃度，如濃度進一步加大，對該酶的活性有抑制作用。盡管鋅是生物生長的必需微量營養(yǎng)素，有關(guān)鋅如何吸收和調(diào)節(jié)的機制研究相對較少。人們早已認同微藻是功能食品及藥品的有效來源。因此揭示微藻利用鋅的機制，闡明活性物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)化的途徑就顯得尤為重要。而目前在這一方面的研究較少。

細胞膜電位和膜電阻的大小與膜完整性、通透性密切相關(guān)，能夠靈敏反映細胞生命狀態(tài)或其受損程度。應(yīng)用流式細胞技術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)對細胞膜電位和膜通透性變化的研究已有所報道[9-10]。但大多數(shù)研究對象為動物細胞[11-12]。利用FCM對熒光物質(zhì)的檢測，研究藻細胞對鋅的不同通透性和攝取動力學(xué)的研究還未見報道，且這方面研究所展示的前景是值得期待的。故本實驗以球等鞭金藻3011(Isochrysis galbana3011)為生物材料，建立非創(chuàng)傷性藻細胞膜電位變化檢測方法，研究Zn2+對藻細胞膜電位和膜通透性的影響，探討其對膜電信號的影響特性，比較處理前后細胞膜電位的變化規(guī)律，從細胞水平探討Zn2+的促滲機制，為揭示微藻攝取重金屬離子的機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球等鞭金藻3011(Isochrysis galbana3011)由中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫惠贈。

雙(1,3-二巴比妥酸)-三次甲基氧烯洛爾(DiBAC4(3))、碘化丙啶(PI) 美國Sigma公司；ZnSO4、KCl、KBr、NaF、SrCl2等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FACSCalibur流式細胞儀 美國BD公司；倒置熒光顯微鏡 日本尼康公司；超純水系統(tǒng) 美國密里博公司；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 藻種活化與傳代培養(yǎng)

預(yù)培養(yǎng)藻種的基礎(chǔ)營養(yǎng)液配方按人工海水加f/2培養(yǎng)基配制，控制在20～24℃，光照周期(D:L)為12h:12h，培養(yǎng)基初始pH7，光照度為500～1500lx?；罨?次后進行實驗。

1.4 鋅刺激

以f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)Isochrysis galbana3011到指數(shù)生長期，分成8組，同時分別添加一定ZnSO4溶液，使Zn2+終質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40、80、160、320μg/L，染色，以流式細胞儀檢測膜電位和膜通透性，以熒光顯微鏡鏡檢染色后細胞狀態(tài)。

1.5 流式細胞術(shù)檢測

熒光染料PI用Milli-Q超純水配制成5mg/mL，4℃避光保存，將DiBAC4(3)溶于無水乙醇配成1mg/mL儲備液，4℃避光保存。培養(yǎng)到指數(shù)期的樣品以無菌PBS緩沖液洗滌，10000r/min離心15min，并重復(fù)2～3次，稀釋成106cells/mL以下，對具有Isochrysis galbana3011細胞形態(tài)的細胞上樣，各取1mL樣品加入流式管中，以此時的熒光值作為陰性對照，以20μg/mL終質(zhì)量濃度PI染色，避光孵育15min后，上樣。DiBAC4(3)終質(zhì)量濃度為2μg/mL，避光孵育20min后，上樣，每隔1min記錄。DiBAC4(3)、PI標(biāo)記的同樣細胞密度的上樣管認為是靜息膜電位作為陰性管，同樣標(biāo)記并分別添加一定量的ZnSO4溶液的上樣管作為陽性管。流式細胞儀系用氳離子激光激發(fā)光源，功率15mW，發(fā)射光波長488nm，DiBAC4(3)的綠色熒光用530nm/30nm帶通濾片收集，PI發(fā)出的紅色熒光用585nm/42nm帶通濾片收集，分析細胞數(shù)為10000，熒光強度對數(shù)模式測定。PI、DiBAC4(3)染色時，當(dāng)熒光強度大于對照細胞時認為是PI+、DiBAC4(3)+，當(dāng)熒光強度低于對照細胞時，認為染色為PI－、DiBAC4(3)－，應(yīng)用Cellquest軟件(Becton Dickinson)收集、儲存、處理數(shù)據(jù)。結(jié)果以染色細胞數(shù)占門內(nèi)細胞數(shù)百分?jǐn)?shù)表示。

1.6 熒光顯微鏡觀察

將各組細胞樣品以同樣染料濃度染色后涂于玻片上，立即在玻片上觀察，每隔1min照相記錄。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果均以±s表示。采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析(One way ANOVA)。進一步進行組間兩兩比較時，若方差齊時，采用SNK檢驗；若方差不齊時，采用Games-Howell檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 FCM檢測Zn2+對Isochrysis galbana3011的影響

當(dāng)細胞膜完好時，PI不能進入細胞內(nèi)，當(dāng)細胞凋亡或死亡后，因為細胞膜缺損而進入細胞發(fā)熒光，故檢測PI的熒光強度可以作為Zn2+影響Isochrysis galbana3011細胞膜通透性的指標(biāo)。由表1可見，隨Zn2+刺激質(zhì)量濃度的增大，對細胞膜的通透性影響逐漸變大；以5μg/L和10μg/L Zn2+處理組對細胞膜的影響最顯著，分別以處理6min和7min與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。10μg/L Zn2+處理組處理6min和7min，被PI著色的胞膜破損的細胞占門內(nèi)細胞總數(shù)的0.6%～0.7%左右，且趨勢為逐漸減小，可解釋為對Isochrysis galbana3011細胞膜通透性的影響越來越小。相反以5μg/L的Zn2+加入量處理7min，被PI著色的細胞占門內(nèi)細胞總數(shù)的47%左右，說明5μg/L的Zn2+加入量對細胞膜通透性影響最大，細胞膜受損最嚴(yán)重。這些結(jié)果明顯小于目前以獲取生物量為培養(yǎng)目的的Zn2+加入量[13-14]，0.2～50mg/L為促進質(zhì)量濃度，100mg/L以上為抑制質(zhì)量濃度。

氧雜菁(oxonol)類的DiBAC4(3)是陰離子性慢反應(yīng)的親脂性膜電位敏感熒光探針，根據(jù)其在細胞內(nèi)外及線粒體內(nèi)外重新分布來判斷細胞膜電位的變化。細胞受到Zn2+刺激后，攝取DiBAC4(3)，使之與細胞內(nèi)成分結(jié)合，引起細胞內(nèi)熒光強度瞬時上升。當(dāng)DiBAC4(3)進入細胞內(nèi)增多時，熒光強度增強，表明細胞膜電位負值減小，細胞膜發(fā)生去極化；反之，當(dāng)DiBAC4(3)進入細胞內(nèi)減少時，熒光強度減弱，表明細胞膜電位負值增加，細胞膜發(fā)生超極化。由表2可知，加入5μg/L Zn2+后，Isochrysis galbana3011細胞表現(xiàn)受到Zn2+刺激后胞內(nèi)熒光強度瞬時增強，從刺激4min開始到7min結(jié)束。這一質(zhì)量濃度處理組的膜電位變化與對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其他處理組細胞內(nèi)前后熒光強度并無明顯的增高或降低。顯示Zn2+可引起Isochrysis galbana3011細胞膜電位去極化，且其效應(yīng)非一定范圍內(nèi)隨Zn2+質(zhì)量濃度變化而變化，而是5μg/L Zn2+達到極值。

表1 Zn2+對Isochrysis galbana 3011細胞膜通透性(PI+/ DiBAC4(3)－)的影響(x±s，n=3)Table 1 Effect of Zn2+ on membrane permeability (PI+/ DiBAC4(3)－) of Isochrysis galbana 3011 (x±s，n=3) %

表2 Zn2+對Isochrysis galbana 3011細胞膜電位(PI+/ DiBAC4(3)－)的影響(x±s，n=3)Table 2 Effect of Zn2+ on membrane potential (PI+/ DiBAC4(3)－) of Isochrysis galbana 3011 (x±s，n=3)%

細胞膜安靜狀態(tài)下電位是內(nèi)負外正，當(dāng)受到刺激之后有部分變成內(nèi)正外負，膜電位負值減小。由結(jié)果推測，Zn2+對膜電位的影響應(yīng)該和兩種因素有關(guān)：電荷密度以及本身對細胞膜的作用。Zn2+首先和細胞膜接觸并起作用，使得細胞去極化，膜電位負值降低，而染料是帶負電的，所以在電場的驅(qū)動之下進入細胞；但同時由于Zn2+帶正電，這種正電的存在對去極化的結(jié)果有一定負的補償效應(yīng)。隨著 Zn2+質(zhì)量濃度的增大(0～5μg/L)其對細胞膜的作用增強，導(dǎo)致其去極化效果越明顯，但同時隨著電荷密度的增大，其負的補償效應(yīng)也越不明顯。這也就是表2中隨Zn2+質(zhì)量濃度增大(5～320μg/L)對細胞膜電位改變影響不大的原因。對于5μg/L Zn2+而言，負的補償效應(yīng)最大，這個因素占主要地位因而顯示了對膜電位改變的最大值。

細胞膜電位是由于某些離子如K+、Na+等在細胞膜兩側(cè)的不均衡分布，以及這些離子在膜兩側(cè)分布發(fā)生改變而形成的，因此凡影響到細胞膜內(nèi)外離子濃度或其分布以及細胞膜狀態(tài)的因素都可引起細胞膜電位的改變。由此可見Zn2+進入藻細胞的作用機理與膜電位的改變誘發(fā)鈉通道聯(lián)動有關(guān)。提示鈉通道可能是Zn2+引起膜電位去極化的作用機制之一。這與有些研究顯示Zn2+誘使膜通透性轉(zhuǎn)運孔的打開相似[15]。

膜脂質(zhì)組成及膜生物物理特性的改變與細胞的許多功能變化有關(guān)，它可影響物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運、膜結(jié)合酶活性、配體與膜受體的結(jié)合、細胞的分化與細胞識別等方面。膜電位是細胞膜上各種泵為維持細胞內(nèi)外不同離子濃度梯度而形成的，是細胞膜最重要的生物物理特性之一，細胞跨膜電位梯度的改變，伴有膜脂質(zhì)動力學(xué)及膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)及膜特性的變化，如膜的微黏滯性、離子通透性、膜的厚度或膜蛋白結(jié)構(gòu)的變化等[16]。目前膜電位的測定主要有3種方法，分別是倒置熒光顯微鏡法、激光掃描共聚焦顯微鏡法和流式細胞技術(shù)，都是

采用DiBAC4(3)作為膜電位熒光探針。DiBAC4(3)染料可以快速檢測膜電位的動態(tài)變化，且不損傷細胞[17-18]。利用熒光染料DiBAC4(3)和流式細胞儀檢測細胞膜電位，這一方法具有操作簡單，重復(fù)性好的特點，可無損傷地測定不同大小的細胞膜電位，與離子通道特異性激動劑和拮抗劑合用，可快速反映藥物對離子通道的影響。倒置熒光顯微鏡法比較簡單，但缺點是無法對多個細胞進行檢測；激光掃描共聚焦顯微鏡法樣品準(zhǔn)備過程復(fù)雜，實驗成本高，成像時間較長，不利于測量膜電位的快速變化。

2.2 Zn2+刺激后Isochrysis galbana3011的熒光強度檢測結(jié)果

圖1 5μg/L Zn2+處理Isochrysis galbana 3011的PI單染狀況Fig.1 Fluorescent micrographs of Isochrysis galbana 3011 with the exposure of 5μg/L Zn2+ and PI staining

圖2 5μg/L Zn2+處理Isochrysis galbana 3011的DiBAC4(3)單染狀況Fig.2 Fluorescent micrographs of Isochrysis galbana 3011 with exposure of 5μg/L Zn2+ and DiBAC4(3) staining

PI與細胞內(nèi)DNA和RNA物質(zhì)相作用生成紅色熒光物質(zhì)，在Zn2+作用下膜破裂，產(chǎn)生一定通透性，細胞內(nèi)含物被PI染成紅色。DiBAC4(3)使細胞在藍色光下發(fā)出綠色熒光，去極化的細胞發(fā)出強烈的綠色熒光。DiBAC4(3)單染顯示熒光物質(zhì)充滿整個細胞，使細胞發(fā)出亮綠色而且可以非常清楚地辨別細胞形狀。由圖1可見，處理7min較多細胞出現(xiàn)紅色熒光，說明細胞通透性受到極大影響，這一結(jié)果與流式細胞儀的檢測結(jié)果相似。相比表1中流式細胞儀的檢測結(jié)果5μg/L Zn2+處理0min與7min被PI著色的細胞數(shù)占門內(nèi)細胞數(shù)的3%和 47%，這一結(jié)果與圖1處理0min與7min能發(fā)出紅色熒光的細胞數(shù)比例基本一致。由圖2可見，有些細胞出現(xiàn)綠色熒光說明這些細胞正處于去極化狀態(tài)，這一結(jié)果也與流式細胞儀的檢測結(jié)果相似。在表2中5μg/L Zn2+處理Isochrysis galbana3011 0min與5min通過DiBAC4(3)染色細胞發(fā)生去極化的比例分別為0.7%和14%左右，與圖2發(fā)出綠色熒光的細胞比例基本一致。表明用熒光顯微鏡觀察的方式進一步印證了流式細胞儀的檢測結(jié)果。

3 結(jié) 論

3.1 獲得了動態(tài)快速檢測Isochrysis galbana3011細胞膜電位與膜通透性變化的方法，即DiBAC4(3)、PI染色結(jié)合流式細胞儀檢測與倒置熒光顯微鏡鏡檢，可以在不損傷細胞膜的基礎(chǔ)上更精確、更便捷地反應(yīng)細胞膜電位與膜通透性的變化趨勢。

3.2 5μg/L的Zn2+能顯著引起Isochrysis galbana3011細胞膜的部分去極化，并改變膜的通透性，該結(jié)果與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.3 Zn2+進入藻細胞的作用機理與膜電位的改變誘發(fā)鈉通道聯(lián)動有關(guān)及與膜通透性轉(zhuǎn)運孔的打開有關(guān)。該結(jié)果可為揭示微藻攝取重金屬離子的機理，具富鋅功能性的海洋食品的研發(fā)提供參考。

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Effect of Zn2+on Membrane and Membrane Permeability ofIsochrysis galbana3011

ZHAO Pei，WANG Xue-qing*，CHEN Qing-sen， PENG Bo-li，KANG Kai，CHEN Huan
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Flow cytometry and fluorescence microscope were used to explore the effect of Zn2+on membrane potential and membance permeability inIsochrysis galbana3011. The processed microalga were detected by flow cytometry and fluorescence microscope with DiBAC4(3) and PI staining through single-factor tests. The statistical software of SPSS 17.0 was used for variance analysis of the data. The results showed that the membrane potential in macrophage was increased significantly and the membance permeability was changed after stimulated with Zn2+in 5μg/L for 4 min. Therefore, a dynamic membrane status was observed and 5μg/L Zn2+could lead to partial membrane depolarization and change the membance permeability ofIsochrysis galbana3011, which may be linked to sodium ion channel.

Isochrysis galbana3011；Zn2+；flow cytometry；membrane potential；membrane permeability

Q949.2

A

1002-6630(2012)05-0066-05

2011-04-11

天津市自然科學(xué)基金重點項目(08JCZDJC16600)

趙培(1978—)，女，講師，碩士，主要從事微藻生理生化研究。E-mail：zhaopei@tjcu.edu.cn

*通信作者：王雪青(1962—)，女，教授，博士，主要從事微藻生理生化研究。E-mail：wangxq@tjcu.edu.cn