馬君剛，張煌濤，于 紅，任水英*

(國家農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗中心(新疆)，新疆 烏魯木齊 830004)

GPC-HPLC-FLD法測定動植物油脂中的苯并(a)芘

馬君剛，張煌濤，于 紅，任水英*

(國家農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗中心(新疆)，新疆 烏魯木齊 830004)

建立動植物油脂中苯并(a)芘殘留量的凝膠凈化-高效液相色譜-熒光檢測的測定方法。方法采用凝膠色譜凈化系統(tǒng)處理樣品，可除去油脂中甘油三酯等雜質(zhì)的干擾。色譜條件：Hypersil ODS2(150mm×4.6mm，5μm)反相色譜柱，流動相為甲醇-水(94∶6，V/V)，流速1.0mL/min，激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長406nm，柱溫30℃。方法的檢出限0.1μg/kg，線性范圍0.1～50μg/kg，加標(biāo)回收率92.0%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.86%(n＝6)。該法具有樣品預(yù)處理簡單、靈敏度高、精密度高等優(yōu)點，可用于動植物油脂樣品中苯并(a)芘的快速準(zhǔn)確測定。

苯并(a)芘；GPC凈化系統(tǒng)；高效液相色譜；熒光檢測；動植物油脂

苯并(a)芘，即3,4-苯并芘，是一種高活性致癌劑。苯并(a)芘可通過呼吸、食道、皮膚吸收等途徑進(jìn)入人體，主要可誘發(fā)皮膚、肺、消化道和膀胱癌[1]，同時可損害中樞神經(jīng)、破壞淋巴細(xì)胞、影響肝臟功能和DNA修復(fù)能力等，具有致畸、致突變作用。苯并(a)芘對人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)也有一定的干擾作用，對人類的生存和繁衍構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[2]。

苯并(a)芘廣泛存在于自然環(huán)境中，食品中也不例外，如煙熏食品、燒烤肉食品、油炸食品、動植物油脂等，被認(rèn)為是由煤炭、石油、天然氣、木材等不完全燃燒產(chǎn)生的[3]。文獻(xiàn)中關(guān)于水質(zhì)[4]、空氣[5-7]、油炸食品[8]以及肉制品[9-10]中的苯并(a)芘檢測方法報道很多，動植物油脂中苯并(a)芘的檢測也一直處于探索階段?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.27—2003《食品中苯并(a)芘的測定》[11]、GB/T 22509—2008《動植物油脂苯并(a)芘的測定：反相高效液相色譜法》[12]前處理步驟繁多，耗時費力，條件苛刻；陶順興等[13]、蔡玉枝等[14]采用甲酸除去樣品中的色素等雜質(zhì)，再用甲酸咖啡因萃取經(jīng)凈化的樣品中的苯并(a)芘，同樣存在著前處理復(fù)雜等問題。吳海智等[15]采用直接將油脂稀釋定容的方法進(jìn)行前處理，雖然簡便，但干擾雜質(zhì)多，檢出限高，對色譜柱污染也很嚴(yán)重。本方法采用GPC凝膠凈化系統(tǒng)除去干擾物質(zhì)，建立凝膠滲透色譜-高效液相色譜-熒光檢測(gel permeation chromatography-high performance liquid chromatograghy-fluorescence detector，GPC-HPLC-FLD)簡便、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

動植物油脂 市售。

苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.5%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司；環(huán)己烷、乙酸乙酯和四氫呋喃(均為分析純) 天津永大化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇(均為色譜純)美國Fisher公司；水為艾科浦超純水機(jī)制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

GPC凈化系統(tǒng)配紫外檢測器、AccuPrep MPSTM GPC快速凈化柱 美國J2 Scientific公司；1100型液相色譜儀(配熒光檢測器) 美國安捷倫公司；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；N-EVAPTM 116氮吹儀美國Organomation公司；艾科浦超純水機(jī) 重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為100μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再分別準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，稀釋成0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 樣品處理

稱取約1.0g(精確到0.1mg)樣品，用環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1)溶解并定容于10.0mL，將稀釋液轉(zhuǎn)移至GPC配備的樣品瓶中，上樣于GPC凈化系統(tǒng)。以環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1)為流動相，流速4.7mL/min凈化，收集16～22min的洗脫液，將所得的洗脫液在氮吹儀上(40℃)吹干或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸干，用乙腈-四氫呋喃(90∶10)溶液溶解并定容于0.5mL，用0.45μm有機(jī)濾膜過濾后待測。

1.5 高效液相色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2(150mm×4.6mm，5μm)，流動相：甲醇-水(94∶6，V/V)，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃；激發(fā)波長：365nm；發(fā)射波長：406nm，進(jìn)樣量10μL。

1.6 苯并(a)芘的定性定量方法

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間對樣品峰進(jìn)行準(zhǔn)確定性，采用外標(biāo)法以峰面積計算定量，將不同質(zhì)量濃度的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度/(μg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 加標(biāo)回收率及精密度實驗

VR作為一種新興的媒體技術(shù)，給我們帶來了一種全新的產(chǎn)品體驗方式，但是現(xiàn)階段，比起個人用戶市場，VR技術(shù)更適用于企業(yè)市場，將VR技術(shù)融合到公司的產(chǎn)品和服務(wù)中已經(jīng)顯示出了獨一無二的優(yōu)勢。VR內(nèi)容是企業(yè)品牌很好的宣傳素材，完美契合品牌營銷的基因，VR全景可以實現(xiàn)企業(yè)真實環(huán)境、真實產(chǎn)品的全景展示，分享在互聯(lián)網(wǎng)上，用戶只需要用鼠標(biāo)左鍵就可以在同一個文件中前、后、上、下、左、右、遠(yuǎn)、近全方位了解企業(yè)環(huán)境或產(chǎn)品實景。720度全景震撼的全景展示效果以及其真實可靠的信息能夠吸引客戶的眼球，更深入地了解企業(yè)。

將苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白樣品中，配制成苯并(a)芘質(zhì)量加標(biāo)量為5.0μg/kg的測試樣品，用兩種國標(biāo)方法和本論文所建立的方法分別測定苯并(a)芘含量，測試6次，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。并對6種動植物油脂樣品及苯并(a)芘加標(biāo)量為10.0、20.0μg/kg的樣品進(jìn)行分析測試，計算檢出限、精密度、回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPC凈化系統(tǒng)的使用

本實驗采用GPC凈化系統(tǒng)處理樣品。為確定苯并(a)芘的洗脫時間，取大濃度的苯并(a)芘溶液上樣，在波長254nm處檢測，GPC凈化系統(tǒng)條件設(shè)置同1.4節(jié)，得到譜圖如圖1所示。樣品中的苯并(a)芘在16～22min內(nèi)被洗脫完全，故樣品處理可依此時間段收集洗脫液。用樣品進(jìn)行實驗，得到譜圖如圖2所示，可知甘油三酯等較大分子均在16min前得到完全洗脫，16～22min收集的洗脫液中不含或含較少量甘油三酯等較大分子。該方法實現(xiàn)了樣品前處理的自動化，減少了前處理步驟，最大限度的降低了待測組分的損失。同時，可去除雜質(zhì)干擾物，避免了油脂分子進(jìn)入液相色譜柱干擾測試，保護(hù)了色譜柱，延長其使用壽命，并提高的儀器的靈敏度。

圖1 苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的GPC色譜圖Fig.1 Gel permeation chromatogram of standard benzo (a) pyrene

圖2 樣品的GPC色譜圖Fig.2 Gel permeation chromatogram of sample

2.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜條件對檢測起著至關(guān)重要的作用，因此對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。比較幾種流動相配比條件下的色譜峰，最后發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇∶水＝94∶6時，保留時間、容量因子適當(dāng)，基線噪聲最低，同時苯并(a)芘和樣品中干擾物能達(dá)到較好的基線分離。對苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用激發(fā)波長365、375、384nm，發(fā)射波長406、410、415nm進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)激發(fā)波長384nm、發(fā)射波長406nm時，苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值最大。標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽性樣品的液相色譜圖如圖3所示。

圖3 苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)及陽性樣品(B)的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of benzo (a) pyrene standard and positive sample

2.3 高效液相色譜柱的選擇

本實驗考察數(shù)家不同廠家、不同牌號的色譜柱，包括Hypersil ODS2、ZORBAX Eclipse XDB C18、symmetry C18、LiChrosob RP-18、LUNA C18、Inertsil ODS-3、ZORBAX Eclipse PAH。發(fā)現(xiàn)每種色譜柱均能滿足用本方法處理后的樣品測試，并不需要諸如ZORBAX Eclipse PAH等多環(huán)芳烴專用分析柱。因此本實驗選用價格相對低廉的Hypersil ODS2色譜柱。

將不同濃度的加標(biāo)樣品進(jìn)行處理并測試，以質(zhì)量濃度/(μg/L)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸，線性方程為Y＝1.83×107X＋1025，線性范圍為0.1～50ng/mL；線性相關(guān)系數(shù)為0.9991。以3倍噪聲值與最小濃度的色譜峰峰高比較，計算出檢出限為0.1ng/mL，按測定方法計算，本方法最低檢出限為0.1μg/kg，線性范圍0.1～50μg/kg。對抽取的樣品進(jìn)行處理分析，并做了不同濃度的加標(biāo)實驗，表1為6種樣品以及10、20μg/kg加標(biāo)量的分析結(jié)果，從表1可以看出，樣品的加標(biāo)回收率處于92.0%～106.0%之間。

表1 6種樣品的測試結(jié)果及加標(biāo)回收率Table 1 Results of six samples and recovery

3 討 論

3.1 本方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的對比

現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中可用于動植物油脂中苯并(a)芘檢測的方法有GB/T 5009.27—2003、GB/T 22509—2008。本實驗與這兩種國標(biāo)方法相比均根據(jù)苯并(a)芘的熒光特性，采用成熟的熒光分光光度計或高效液色譜儀-熒光檢測器進(jìn)行檢測，但在樣品前處理過程中三者區(qū)別很大。眾所周知，現(xiàn)代儀器分析中耗費時間和精力最多、對結(jié)果準(zhǔn)確性影響最大的因素即為樣品前處理?，F(xiàn)對3種方法的前處理過程對比如下：

GB/T 5009.27—2003采用熒光分光光度計測試，由于未通過色譜柱將苯并(a)芘與油脂中甘油三酯等干擾物分離，必須通過液-液萃取、氧化鋁層析柱凈化、紙色譜分離等復(fù)雜的前處理步驟將苯并(a)芘從油脂中提取出來。該操作過程繁雜，實驗周期長，勞動強(qiáng)度大，同時由于無法保證不同批次間氧化鋁和紙色譜用濾紙條的活度、特性一致，此方法的最小檢出量高，精密度較差、回收率也較低。

GB/T 22509—2008采用Brockmann活度Ⅳ級的中性氧化鋁層析柱對樣品進(jìn)行凈化處理。利用中性氧化鋁中鋁原子與苯并(a)芘等芳香烴類富電子化合物的作用力，使之保留在層析柱上。然而中性氧化鋁作為正相色譜中具有強(qiáng)極性保留的填料，同樣對動植物油脂中主要組份甘油三酯等分子結(jié)構(gòu)上具有極性酯基的油脂分子有保留作用。由于樣品甘油三酯含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于苯并(a)芘含量，兩者含量之差可達(dá)十億倍以上，這就很難保證在不損失或少損失苯并(a)芘的前提下，過柱后的樣品處理液中油脂分子能夠減少到不影響極微量苯并(a)芘測定的含量水平。雖然可以通過調(diào)節(jié)中性氧化鋁中含水量來嚴(yán)格控制其Brockmann活度，達(dá)到保證油脂分子與苯并(a)芘的最大分離度，但這種平衡關(guān)系對氧化鋁中含水量的微小變化非常敏感。樣品、洗脫液中微量的水分不可避免的被極易吸水的氧化鋁吸附后必將破壞最初建立的實驗條件與效果。同樣會導(dǎo)致檢出限、精密度、回收率無法得出滿意的結(jié)果。

本方法通過GPC凈化系統(tǒng)處理樣品，可去除樣品中的油脂分子、色素等雜質(zhì)的干擾。GPC凈化系統(tǒng)原理為體積排阻色譜，可根據(jù)樣品分子中各組分分子質(zhì)量的不同將其分離，分子質(zhì)量大的組分先流出，分子質(zhì)量越小的組分越容易被凝膠顆粒中的孔洞所阻滯，流出越慢。油脂的皂化值一般在180～200mg/g之間，由此可算出其主要成分甘油三酯的平均相對分子質(zhì)量在800～1000之間。油脂中甘油三酯平均相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量僅為252的苯并(a)芘相比，差異很大，這使得兩者在GPC凈化系統(tǒng)中能夠得到很好的分離，達(dá)到去油效果。同時體積排阻色譜的分離機(jī)理只與分子質(zhì)量相關(guān)，樣品組分和固定相之間保留機(jī)理簡單，兩者之間原則上不存在相互作用力，使得凝膠凈化柱清洗過程簡單，使用壽命長，即使大量、多次上樣也很容易恢復(fù)到初始柱效。而采用商品化成品柱，性能穩(wěn)定，質(zhì)量有充分保證?；谝陨蟽?yōu)點，本方法實驗過程中不需過多考慮凈化柱的次級保留效應(yīng)，以及樣品中強(qiáng)保留的雜質(zhì)分子滯留在柱上引起凈化柱保留特性的改變等因素，使得整個凈化過程發(fā)始終在可控條件下運行，避免了國標(biāo)方法需時刻關(guān)注不同批次試劑質(zhì)量，二氧化鋁活性變化，樣品污染凈化柱，待測組分與雜質(zhì)分離不完全等因素引起的工作量加大，苯并(a)芘損失，精密度下降，方法無法重現(xiàn)的現(xiàn)象。

將一空白樣品加標(biāo)配制成苯并(a)芘為5.0μg/kg的測試樣，用3種方法分別測試6次，檢出限、精密度、回收率見表2。表明本實驗建立的方法在這些參數(shù)方面均優(yōu)于兩種國家標(biāo)準(zhǔn)，測試結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。3.2 注意事項

表2 苯并(a)芘3種檢測方法的參數(shù)比較Table 2 Parameter comparison of three detective methods of benzo (a) pyrene

該檢測方法使用熒光檢測器，熒光檢測器靈敏度高，對于極微量的苯并(a)芘既有較高的響應(yīng)值。然而，苯并(a)芘廣泛存在于自然界中，特別是有機(jī)試劑在生產(chǎn)、運輸、儲存過程中極易產(chǎn)生苯并(a)芘，因此對于靈敏度極高的本方法，很容易產(chǎn)生假陽性。所以本方法對試劑提出了嚴(yán)格的要求，GPC凈化系統(tǒng)的洗脫液最好使用高純的環(huán)己烷和乙酸乙酯；若使用分析純試劑，必須進(jìn)行空白實驗，并在結(jié)果計算時給予扣除。另外，液相色譜流動相中溶解的少量氧氣易產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)，即使帶有在線脫氣機(jī)的儀器，流動相在使用前也要脫氣處理。

4 結(jié) 論

本實驗建立了動植物油脂中苯并(a)芘殘留量的測定方法，該方法樣品前處理簡單，去除雜質(zhì)效果好，靈敏度高，精密度、方法復(fù)現(xiàn)好等優(yōu)點，是測定動植物油脂中苯并(a)芘含量的理想方法。

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Determination of Benzo(a) pyrene in Animal Fats and Vegetable Oils by Gel Permeation- High Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detector

MA Jun-gang，ZHANG Huang-tao，YU Hong，REN Shui-ying*
(National Quality Supervision Test Center of Agricultural Byproducts (Xinjiang), U..ru..mqi 830004, China)

This paper describes a method to determine benzo(a) pyrene in animal fats and vegetable and oils using gel permeationhigh performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD). In this method, gel permeation cleanup system was used to remove the interference such as triglyceride. Chromatographic separation was achieved by a reverse-phase column of Hypersil ODS2 with the mobile phase consisting of methanol-water (94∶6,V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. FLD were set at 365 nm excitation and 406 nm emission wavelengths, and the column temperature was kept at 30 ℃. The limit of detection was 0.1μg/kg, the calibration curve was linear between a concentration range of 0.1－50μg/kg, the recoveries were in the range of 92.0%－106.0%, and RSD (n＝ 6) value was 1.86%. The method is simple, rapid, accurate and sensitive for directly determining benzo(a)pyrene in animal fats and vegetable oils without complicated and time-consuming separation process.

benzo(a)pyrene；GPC cleanup system；high performance liquid chromatography (HPLC)；fluorescence detection (FLD)；animal fats and vegetable oils

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0278-04

2011-04-30

馬君剛(1974—)，男，高級工程師，碩士，主要從事食品檢驗研究。E-mail：mjg205270@sina.com

*通信作者：任水英(1981—)，女，工程師，碩士，主要從事食品檢驗研究。E-mail：renshuiying@yahoo.com