郭慶龍，崔淑華*，段 浩，林黎明，錢家亮，許美玲，吳淑秀

(1.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；2.臨沂出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 臨沂 276034；3.山東省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，山東 青島 266002)

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬果中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺殘留

郭慶龍1，崔淑華2,*，段 浩2，林黎明3，錢家亮2，許美玲2，吳淑秀2

(1.黃島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266555；2.臨沂出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 臨沂 276034；3.山東省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，山東 青島 266002)

建立蔬菜和水果中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。將試樣中殘留的啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺用含1%乙酸的乙腈溶液均質(zhì)提取，提取液混合使用乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷鍵合相基質(zhì)分散凈化，用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測和確證，外標(biāo)法定量；方法通過空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)建立校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以消除基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明：啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺在1～100μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.9996和0.9997；在5～50μg/kg范圍內(nèi)，平均添加回收率在77.7%～93.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～6.3%之間。啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺方法定量限分別為1.32μg/kg和1.20μg/kg，檢出限分別為0.395μg/kg和0.361μg/kg。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；啶酰菌胺；環(huán)酰菌胺；蔬菜；水果

啶酰菌胺(boscalid)和環(huán)酰菌胺(fenhexamid)是新型酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，這兩種殺菌劑對防治灰霉病、菌核病和各種腐爛病等病害非常有效，并且對其他藥劑的抗性菌亦有效，主要用于包括蔬菜、果樹和大田作物等病害的防治。由于其特有的作用機理不易產(chǎn)生交互抗性，加之對作物安全、與環(huán)境相容性良好，是應(yīng)用前景很好的兩種新型酰胺類殺菌劑[1-6]?；诎踩紤]，CAC、歐盟和日本等國家規(guī)定規(guī)定啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺在各類食品中最高殘留限量在ND～40mg/kg和0.02～30mg/kg之間[7-9]。國內(nèi)外對該化合物殘留檢測方法的報道較少[10-18]，而且國內(nèi)殘留分析前處理方法較繁瑣。因此，研究食品中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺快速準(zhǔn)確的分析方法極為迫切和必要。本研究參照QuEChERS前處理技術(shù)的分散固相萃取技術(shù)[19-20]，采用混合吸附劑凈化，擬建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(high-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，HPLC-MS/MS)測定蔬菜和水果中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種基質(zhì)(草莓、葡萄、黃瓜、大蔥) 市售。

乙腈、甲醇、乙酸(均為色譜純) 德國Merke公司；氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純，用前在450℃烘5h，200℃時取出至于干燥器內(nèi)備用) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Cleanert PSA凈化劑(40～60μm)、Cleanert ODS C18-N(未封端)凈化劑(40～60μm)、Cleanert Pesti Carb 凈化劑(120～400μm) 天津博納艾杰爾科技有限公司；啶酰菌胺(純度≥99.5%)、環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200快速液相色譜儀-6410Triple Quad質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；5810R型離心機德國Eppendorf公司；ULTRA-TURRAX T-18 basic型均質(zhì)器、MS3基本型旋渦混合器 德國IKA公司；MilliQ超純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品12.56mg置于50mL小燒杯中，用乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，然后多次洗滌小燒杯并將其轉(zhuǎn)移至容量瓶中，最后用乙腈定容至刻度，分別配成500μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確吸取啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1mL于50mL棕色容量瓶中，用含1%乙酸的乙腈溶液定容至刻度，配成10μg/mL啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。然后準(zhǔn)確吸取1mL 10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液于10mL容量瓶中，用含1%乙酸的乙腈溶液定容，配成1.0μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要使用前用空白樣品基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 測定條件

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(2.1mm×100mm，1.8μm)；流動相：甲醇-5mmol乙酸銨溶液(pH3.5)(75:25，V/V)；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣體積：5μL；柱溫：30℃。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multi-reaction monitoring，MRM)；霧化器壓力：40psi；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：9.0mL/min；毛細(xì)管電壓：3500V；監(jiān)測離子對、毛細(xì)管出口電壓/碎裂電壓和碰撞能量等質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Instrumental parameter setting for MS-MS detection of boscalid and fenhexamid

1.3.3 樣品前處理

稱取5g(精確至0.01g)均勻樣品置于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入10mL含1%乙酸的乙腈溶液，2.0g無水硫酸鎂，1.0g氯化鈉，均質(zhì)提取。以5000r/min離心5min。吸取2.0mL上層有機相轉(zhuǎn)移至裝有100mg Cleanert ODS C18-N、50mg Cleanert PSA粉末的離心管中，渦旋2min，5000r/min離心5min。取上清液過0.22μm濾膜后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

以乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-5mmol乙酸銨溶液作為流動相時，調(diào)整流動相比例均不能將啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺進(jìn)行分離。以甲醇-5mmol乙酸銨(75:25，V/V)做流動相等度洗脫即可實現(xiàn)這兩種化合物的有效分離，色譜峰對稱尖銳，峰形良好。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用1mg/L的待測化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動注射的方式分別用ESI正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)這兩種農(nóng)藥在ESI+模式下的響應(yīng)值均大大高于在ESI-模式下的響應(yīng)值，因此選擇采用ESI+電離模式。本研究正離子模式全掃描發(fā)現(xiàn)啶酰菌胺(分子式為C18H12Cl2N2O)和環(huán)酰菌胺(分子式為C14H17Cl2NO2)存在很明顯的同位素分子離子峰，分別為343.1、345.1和302.1和304.1。采用0.1mg/L啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別對毛細(xì)管出口電壓進(jìn)行優(yōu)化，從中選出豐度最高的毛細(xì)管出口電壓作為最佳毛細(xì)管出口電壓。然后分別對不同母離子產(chǎn)生的子離子及碰撞能力進(jìn)行優(yōu)化，從中選出豐度最高的碰撞能量作為最佳碰撞能力，選擇兩個豐度比較高的子離子作為定性和定量離子，建立多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1，啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。

圖1 0.01μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液M R M色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 0.01μg/mL boscalid and fenhexamid standard

2.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

電噴霧離子源容易受樣品基質(zhì)的影響。樣品基質(zhì)對離子化有抑制作用，草莓、葡萄對農(nóng)藥離子化影響較弱，黃瓜、大蔥對農(nóng)藥離子化影響較強。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，應(yīng)以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，這樣可使標(biāo)樣和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。

2.4 提取條件的選擇

比較乙腈和乙酸乙酯的提取效果，發(fā)現(xiàn)采用乙酸乙酯作為提取液時，會提取出更多的色素，對化合物離子化抑制更強。同時，采用乙腈提取時，具有可利用鹽析效應(yīng)去除水分，提取樣品時不需加入大量無水硫酸鈉或無水硫酸鎂等優(yōu)勢。另外發(fā)現(xiàn)，對乙腈提取液使用Cleanert PSA凈化劑基質(zhì)固相分散凈化時，其對環(huán)酰菌胺產(chǎn)生強吸附作用，將含1%乙酸的乙腈溶液作為提取液則吸附作用消失，因此，選擇使用含1%乙酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.5 凈化條件的選擇

基質(zhì)分散凈化常用的凈化劑有乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)、十八烷基硅烷鍵合相(C18)、石墨化炭(Pesti Carb)和氨基(NH2)。PSA去除脂肪酸效果較好，在去除色素、甾醇和維生素方面效果一般，而C18和Pesti Carb去除維生素、色素、甾醇的能力較好，NH2與PSA凈化范圍一致，但離子交換能力較PSA弱。凈化劑在去除雜質(zhì)的同時也可能對目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附，將2mL 0.01μg/mL啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺混合標(biāo)液分別經(jīng)不同質(zhì)量的Cleanert ODS C18-N(未封端)、Cleanert PSA和Cleanert Pesti Carb渦旋凈化，處理后的回收率數(shù)據(jù)見表2。

表2 啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)吸附劑處理后的回收率Table 2 Recoveries of boscalid and fenhexamid residues after adsorbed by C18, PSA, Pesti Carb respectively

從表2可看出，Cleanert ODS C18-N對啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺吸附很小，但當(dāng)Cleanert ODS C18-N用量增加至200mg時，其對兩種農(nóng)藥都產(chǎn)生一定程度的吸附。25mg和50mg Cleanert PSA對這兩種農(nóng)藥吸附較弱，但隨其用量的增加，Cleanert PSA對啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺吸附作用增強，尤其對環(huán)酰菌胺吸附更強，10 0 mg Cleanert PSA凈化處理環(huán)酰菌胺后的回收率為79.3%。Cleanert Pesti Carb對2種農(nóng)藥均有一定程度的吸附作用，10mg Cleanert Pesti Carb對啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺吸附回收率分別為40.8%和78.4%，并且隨Cleanert Pesti Carb用量增加吸附更強。本研究結(jié)合凈化劑去雜特性和對目標(biāo)化合物的吸附情況，選擇100mg Cleanert ODS C18-N和50mg Cleanert PSA對蔬菜和水果中基質(zhì)干擾物進(jìn)行凈化。實際試驗發(fā)現(xiàn)，由于1mL提取液中僅含有0.5g樣品基質(zhì)，采用100mg Cleanert ODS C18-N和50mg Cleanert PSA對色素等雜質(zhì)去除效果良好。采用上述方法凈化處理后，對比圖2、3可看出凈化后目標(biāo)物周圍無雜質(zhì)峰干擾，滿足檢測要求。

圖2 大蔥空白樣品中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的MRM色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of boscalid and fenhexamid in a blank welsh onion sample

圖3 大蔥加標(biāo)樣品中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的MRM色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of a welsh onion sample spiked with boscalid and fenhexamid

2.6 方法的線性范圍

將空白樣品按上述提取和凈化過程進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用該基質(zhì)溶液將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成濃度為1、2、5、10、20、50、100μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，HPLC-MS/MS進(jìn)樣分析后，以峰面積(Y)對化合物質(zhì)量濃度(X)作線性回歸，繪制的啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性相關(guān)系數(shù)分別為Y＝814.87X－398.77，r＝0.9996和Y＝854.82X－277.97，r＝0.9997，表明在1～100μg/L范圍內(nèi)線性良好。

2.7 方法的檢出限和定量限

方法檢出限以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比RSN＝3和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)(本方法稀釋倍數(shù)為0.5倍)計算得出。定量限是以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時，取信噪比RSN為10和樣品處理過程的稀釋倍數(shù)(本方法稀釋倍數(shù)為0.5倍)計算得出。啶酰菌胺在黃瓜基質(zhì)中的方法檢出限和定量限分別為0.395μg/kg和1.32μg/kg。環(huán)酰菌胺在黃瓜基質(zhì)中的方法檢出限和定量限分別為0.361μg/kg和1.20μg/kg。

2.8 方法的回收率和精密度

表3 樣品中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的回收率和精密度(n=6)Table 3 Mean recoveries and precisions of boscalid and fenhexamid in sample (n=6)

在陰性草莓、黃瓜、大蔥和葡萄樣品中添加3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，按上述前處理方法進(jìn)行處理，做回收率實驗，每個水平重復(fù)6次，測精密度，結(jié)果見表3。由表3可見，不同添加濃度的平均回收率測定范圍在77.7%～93.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～6.3%之間，其結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度及精密度均可達(dá)到定量分析的要求。

3 結(jié) 論

本實驗參照QuEChERS前處理技術(shù)的分散固相萃取技術(shù)，建立蔬菜和水果中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法用含1%乙酸的乙腈溶液提取樣品中的啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺殘留，同時采用乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷鍵合相混合吸附劑對樣品提取液進(jìn)行凈化，十八烷基硅烷鍵合相彌補了乙二胺-N-丙基硅烷不吸附油脂、色素等弱極性雜質(zhì)的缺點，使凈化更為充分。將此前處理方法結(jié)合HPLC-MS/MS應(yīng)用于蔬菜和水果中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺的同時定性確證和定量檢測，取得了滿意的結(jié)果。該方法具有簡單快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點，能滿足國外最高殘留限量要求。

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Determination of Boscalid and Fenhexamid Residues in Fruits and Vegetables by HPLC-MS/MS

GUO Qing-long1，CUI Shu-hua2,*，DUAN Hao2，LIN Li-ming3，QIAN Jia-liang2，XU Mei-ling2，WU Shu-xiu2
(1. Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266555, China；2. Inspection and Quarantine Technology Center, Linyi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Linyi 276034, China；3. Shandong Inspection & Quarantine and Science &Technology Academy, Qingdao 266002, China)

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was established to determine boscalid and fenhexamid residues in fruits and vegetables. Analytes were extracted from samples using 1% acetic acid acetonitrile, and then purified by solid phase extraction cartridge packaged with sorbent primary secondary amine (PSA) and C18. The residues were determined by high-performance liquid chromatography coupled with tandem MS (HPLC-MS/MS) using external standard method, and the interference of matrix was deducted by the matrix-matched calibration standards curve. A good linearity of calibration curve was exhibited over a concentration range of 1μ g/L to 100μ g/L for boscalid and fenhexamid with a correlation coefficient of 0.9996 and 0.9997, respectively. Average recoveries for boscalid and fenhexamid in 4 samples at spiked levels of 5 － 50 μg/kg were between 77.7% and 93.8%, with a relative standard deviations between 2.1% and 6.3%. For boscalid and fenhexamid, the limit of quantification were 1.32, 1.20 μg/kg and the limit of detection were 0.395, 0.361 μg/kg, respectively.

HPLC-MS/MS；boscalid；fenhexamid；fruits；vegetables

TS207.5

A

1002-6630(2012)10-0255-05

2011-05-06

國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(200910145-2)

郭慶龍(1981—)，男，農(nóng)藝師，碩士，研究方向為植物檢疫與農(nóng)產(chǎn)品安全。E-mail：long_xian1@163.com

*通信作者：崔淑華(1980—)，女，工程師，碩士，研究方向為農(nóng)獸藥殘留分析。E-mail：cuishuh@163.com