韓江雪，丁筑紅*，李仲軍，黃衛(wèi)星

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

不同乳酸菌強(qiáng)化接種發(fā)酵辣椒揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

韓江雪，丁筑紅*，李仲軍，黃衛(wèi)星

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

為更好地了解強(qiáng)化接種發(fā)酵對(duì)辣椒的風(fēng)味特征影響，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)4株乳酸菌強(qiáng)化接種發(fā)酵辣椒風(fēng)味成分。結(jié)果共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)20類191種。不同菌種發(fā)酵樣品風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量有較大差異，發(fā)酵乳桿菌共檢出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)15類76種，乳鏈球菌共檢出8類20種，植物乳桿菌共檢出13類84種，乳酸片球菌共檢出11類73種。經(jīng)主成分分析方法統(tǒng)計(jì)顯示，發(fā)酵乳桿菌的風(fēng)味物質(zhì)綜合評(píng)分為11.28分、乳酸片球菌為3.65分，植物乳桿菌為－0.08分，乳酸鏈球菌為－11.30分，自然發(fā)酵為－3.56分。風(fēng)味物質(zhì)綜合排名為：發(fā)酵乳桿菌＞乳酸片球菌＞植物乳桿菌＞自然發(fā)酵＞乳鏈球菌，發(fā)酵乳桿菌、乳酸片球菌以及植物乳桿菌強(qiáng)化發(fā)酵較自然發(fā)酵辣椒風(fēng)味品質(zhì)突出。

乳酸菌；發(fā)酵辣椒；固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜；主成分分析

發(fā)酵辣椒是一種傳統(tǒng)的地方發(fā)酵蔬菜制品，在我國(guó)貴州、湖南、四川、重慶等地食用廣泛，是日常餐桌食品，深受人們喜愛(ài)。傳統(tǒng)的發(fā)酵辣椒是利用天然附著在辣椒表面的微生物(主要是乳酸菌)進(jìn)行發(fā)酵，加上食鹽的高滲透作用抑制其大部分雜菌的生長(zhǎng)，經(jīng)發(fā)酵而制成[1]。隨著工業(yè)化生產(chǎn)及食品安全需求，人工接種乳酸菌發(fā)酵技術(shù)已有研究和應(yīng)用嘗試，該技術(shù)在縮短發(fā)酵周期、提高安全品質(zhì)方面取得良好效果[2]。

在外源菌種強(qiáng)化發(fā)酵中，由于菌種差異性可能導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味差異性，從而影響產(chǎn)品風(fēng)味。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒的基礎(chǔ)上，選用不同屬的乳酸菌進(jìn)行強(qiáng)化接種，采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法(solid phase micro-extraction-gas chromatograhy-mass spectrometry，SPME-GC-MS)提取樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[3]，并對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，旨在比較不同屬乳酸菌發(fā)酵后的風(fēng)味特性，為生產(chǎn)中合理選用優(yōu)良乳酸菌提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮辣椒：購(gòu)于本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。選用顏色鮮紅，無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉變、無(wú)損傷的新鮮辣椒。清水沖洗后備用。

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、氯化鈉均為分析純。

發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、乳鏈球菌(Streptococcus lactis) 貴州輕化工中心；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

HP6890/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；固相微萃取器(2cm-50/30μm DVB) 美國(guó)Supelco公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將洗凈鮮辣椒去果柄，切成0.5cm×0.5cm的小塊，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的氯化鈉溶液，攪拌均勻后裝入發(fā)酵瓶中。將活化好的乳酸菌按質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的接種量接入發(fā)酵瓶中。30℃發(fā)酵6d。

取發(fā)酵成熟的辣椒80g，裝入進(jìn)樣瓶中加熱到60℃。將活化好的萃取頭插入進(jìn)樣瓶，頂空萃取30min。

1.2.2 GC-MS操作條件

色譜柱：HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane(30m×0.25mm，0.25μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45℃(保留0.5min)，以5℃/min升溫至290℃，保持2min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.62psi，載氣流量1.0mL/min；分流比20:1。

離子源為電子轟擊電離源(electron impact，EI)；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓1037V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～550u[4]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用主成分分析方法(principal component analysis，PCA)。計(jì)算步驟如下：

原始指標(biāo)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化采集，p維隨機(jī)向量x＝(x1,X2,…,XP)T n個(gè)樣品，xi＝(xi1,xi2,…,xip)T，i＝ 1,2,…,n，n＞p，構(gòu)造樣本陣，對(duì)樣本陣元進(jìn)行如下標(biāo)準(zhǔn)化變換：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵樣品總離子流圖

圖1 不同發(fā)酵方式辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the volatile components in fermented chili by Streptococcus

由圖1可知，風(fēng)味物質(zhì)的出峰時(shí)間大部分集中在30min之前。各個(gè)樣品的最大峰度值差異較大，乳酸片球菌最大峰度為1 7 0 0 0 0，植物乳桿菌最大峰度為110000，發(fā)酵乳桿菌最大峰度為320000，乳鏈球菌最大峰度為340000，自然發(fā)酵樣品最大峰度為110000?？蓮目傠x子圖中得出強(qiáng)化接種的樣品在峰度值上有明顯的提高，自然發(fā)酵樣品的僅有兩個(gè)物質(zhì)的峰值在60000以上，而強(qiáng)化接種的峰值大部分都在100000以上。說(shuō)明接種對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的強(qiáng)化有明顯作用。

4種菌種強(qiáng)化接種以及自然發(fā)酵辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)經(jīng)SPME-GC-MS分析后總共檢出18類136種。各樣品檢出情況如表1所示。

由表1可知，接種強(qiáng)化發(fā)酵的辣椒風(fēng)味物質(zhì)種類和數(shù)量上明顯優(yōu)于與自然發(fā)酵辣椒，4種菌種中植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的醇類和醛類物質(zhì)含量較高，乳酸片球菌酮類和酯類物質(zhì)含量較高，乳鏈球菌的風(fēng)味物質(zhì)種類較少，數(shù)量也較低。周曉媛[6]等通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒揮發(fā)性成分進(jìn)行分離鑒定，共得到10類56種化合物，其中烴類最多有20種，其次是醇類有1 3種和酯類有8種，另外酚類、醛類、酮類、縮羰基類、酸類、吡嗪類和其他雜環(huán)類分別是1、3、4、1、3、1、2種。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，檢出的風(fēng)味物質(zhì)種類基本相同，在風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量上存在較小差異，原因與原料選擇、樣品發(fā)酵及處理方式、設(shè)備差異性等有關(guān)。

2.2 揮發(fā)性成分主成分變量選擇

2.2.1 主成分變量篩選

PCA法是一種將多維因子納入同一系統(tǒng)中進(jìn)行定量化研究，理論比較完善的多元統(tǒng)計(jì)分析方法[7]，其基本思想是認(rèn)為在眾多有相關(guān)性的因子之間必然存在著起支配作用的共同因子[8]。通過(guò)確定少數(shù)幾個(gè)主成分因子來(lái)表示原樣本中多個(gè)復(fù)雜的、規(guī)律難尋的變量，并根據(jù)主成分因子在不同樣本中貢獻(xiàn)率的大小，得到樣本問(wèn)規(guī)律性與差異性的評(píng)價(jià)[9]。

通過(guò)2.1節(jié)的分析可知，共同檢出項(xiàng)包括乙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-1-戊醇、正己醇、芳樟醇、2-甲基十三烷、γ-雪松烯、反式-β-羅勒烯、2-正戊基呋喃、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪。所有檢出物質(zhì)中相對(duì)含量在5%以上的有異戊醇、4-甲基-1-戊醇、芳樟醇、乙酸乙酯、乙醇、正己醇、2-甲基-1-丁醇、3-羥基-2-丁酮。烴類檢出種類最多，但這類物質(zhì)中烷烴的香氣一般比較弱，在空氣中也易于氧化變質(zhì)[10]，故風(fēng)味特征不明顯。烯烴類閾值較低，加熱可以促進(jìn)揮發(fā)，是辣椒中的主要呈味物質(zhì)[11]。醇類的檢出量?jī)H次于烴類，醇類化合物包括脂肪族醇、萜醇、芳香族醇等幾大類；脂肪族醇類的氣味，其規(guī)律是隨著物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量的增大，氣味從弱到強(qiáng)，然后又從強(qiáng)到弱；萜醇類香料大多屬花香、青果和蜜香香氣[12]。酯類化合物氣味濃郁，香氣持久，低分子質(zhì)量的酯類一般具有芳香氣味或特定水果香味。醛類物質(zhì)的香氣濃烈，多為果香及花香。酮類具有性質(zhì)穩(wěn)定，香味優(yōu)異持久等特點(diǎn)[13]。呋喃類檢出量雖然較少，但多具有強(qiáng)烈氣味。酚類多有藥香及木香等。含氮類如吡嗪等，具有咖啡等香氣。由于發(fā)酵辣椒的風(fēng)味是由多種物質(zhì)相互作用形成的，所以采用峰面積作為半定量分析風(fēng)味物質(zhì)的依據(jù)。故選擇其中12個(gè)成分及類別作為主成分變量，以峰面積大小為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行主成分分析(表2)。

表 1 不同發(fā)酵方式樣品中檢出的風(fēng)味物質(zhì)類別及數(shù)量Table 1 Type and quantity of flavor compounds detected from different samples

表2 不同樣品中同類風(fēng)味物質(zhì)峰面積Table 2 Peak area of similar flavor in different samples

2.2.2 揮發(fā)性成分主成分分析

由特征值的累計(jì)百分率大于85%(表3)確定主成分個(gè)數(shù)，由此選擇主成分M＝3。最終得到主成分得分表并依據(jù)貢獻(xiàn)率計(jì)算綜合得分(表4)。

表3 主成分積累方差貢獻(xiàn)率Table 3 Accumulated variance contribution rate of principal component

表4 不同樣品綜合評(píng)分及排名Table 4 Composite score and ranking of different samples

依據(jù)綜合評(píng)分高低對(duì)樣品進(jìn)行綜合排名。依次為：發(fā)酵乳桿菌＞乳酸片球菌＞植物乳桿菌＞空白＞乳鏈球菌。依據(jù)綜合評(píng)分，發(fā)酵乳桿菌，乳酸片球菌的風(fēng)味較好。

發(fā)酵乳桿菌的風(fēng)味成分中，芳樟醇、丁醛類、雪松烯、2-甲基十三烷、呋喃類、2-甲氧基-3-異丁基吡嗪的峰面積都屬于最高值。其中，芳樟醇具有花香、木香、柑橘香、漿果香、玫瑰香等[14]；丁醛類中，3-甲基丁醛稀釋后具有愉快的水果香氣，2-甲基丁醛具有果香、巧克力、堅(jiān)果香、青香，正己醛具有青香、葉香、果香，(E)-2-庚烯醛具有油脂香，苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅(jiān)果香氣，2-十一烯醛具有柑橘香、脂肪香、蠟香等；雪松烯具有香柏香、木香等；呋喃類中，2-正戊基呋喃具有豆香、泥土香及類似蔬菜的香韻；2-甲氧基-3-異丁基吡嗪具有胡椒、咖啡的香氣。這些主要成分相互作用，構(gòu)成了發(fā)酵乳桿菌強(qiáng)化接種產(chǎn)生的感官信息。而對(duì)照樣品相對(duì)而言，僅酮類和酚類相對(duì)發(fā)酵乳桿菌含量較高，雖然含有大量的烷烴類物質(zhì)，但是香氣較弱，其他揮發(fā)性物質(zhì)的種類都較少并且含量較低。

乳酸片球菌的風(fēng)味成分中，反式-β-羅勒烯的峰面積高達(dá)249556，具有青香、熱帶果香、萜香、木香；酮類物質(zhì)含量也較高，3-羥基-2-丁酮峰面積為328282，具有甜香、奶香和脂肪的油膩氣息；2-庚酮具有香蕉、奶酪及輕微的藥香。

乳鏈球菌與對(duì)照相比，風(fēng)味物質(zhì)種類非常少，其中乙酸乙酯含量非常高，具有果香及酒樣味道，芳樟醇、烯烴類、醛類等具有優(yōu)良風(fēng)味特征的物質(zhì)含量很低，對(duì)照中各個(gè)風(fēng)味組分含量較均衡，風(fēng)味特征融合較好。

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)SPME-GC-MS分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，采用主成分分析方法，最終得到不同菌種發(fā)酵辣椒風(fēng)味特征的綜合排名為，發(fā)酵乳桿菌＞乳酸片球菌＞植物乳桿菌＞自然發(fā)酵＞乳鏈球菌。與自然發(fā)酵相比較，風(fēng)味物質(zhì)在種類上差別不大，但是在種類和含量上有較大差別，強(qiáng)化接種可以提高發(fā)酵辣椒的優(yōu)良風(fēng)味特性。結(jié)果顯示發(fā)酵乳桿菌、乳酸片球菌適宜強(qiáng)化接種發(fā)酵，為自然發(fā)酵辣椒增加了醛類、醇類和酯類等有益的風(fēng)味物質(zhì)；植物乳桿菌強(qiáng)化發(fā)酵特點(diǎn)不明顯，乳鏈球菌在辣椒中的發(fā)酵特性表現(xiàn)不佳。

乳酸菌在發(fā)酵辣椒制作過(guò)程中對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的呈現(xiàn)發(fā)揮了重要的作用，不同的乳酸菌產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量有較大區(qū)別。強(qiáng)化接種發(fā)酵可以有效提高產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)。吳元鋒[15]等人通過(guò)分析接入不同乳酸菌和自然發(fā)酵泡菜過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)人工接入混合菌種泡菜風(fēng)味較好，是一種較好的低鹽度泡菜生產(chǎn)方法。強(qiáng)化接種的發(fā)酵辣椒與未接種自然發(fā)酵的辣椒相比較，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的類型沒(méi)有改變，但含量及組分分布上有較大改變，在醇類、醛類、烯烴類的含量變化上尤為明顯?？茖W(xué)選用外源菌種，采用強(qiáng)化接種的方式提高發(fā)酵辣椒的綜合品質(zhì)特性是可行的。

[1] 羅鳳蓮, 歐陽(yáng)建勛, 夏延斌. 發(fā)酵辣椒中主要風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2009(7): 346-351.

[2] 余有貴, 曹智華, 曾傳廣. 乳酸菌強(qiáng)化發(fā)酵生產(chǎn)辣椒醬的工藝研究[J]. 中國(guó)釀造, 2009(12): 94-97.

[3] 余澤紅, 賀小賢, 丁勇. 固相微萃取在食品揮發(fā)性組分測(cè)定方面研究進(jìn)展[J]. 糧食與油脂, 2010(7): 44-46.

[4] 李達(dá), 王知松, 丁筑紅. 固相微萃取-氣-質(zhì)聯(lián)用法對(duì)干椒烘焙前后風(fēng)味化合物的分析評(píng)價(jià)[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(16): 269-271.

[5] 傅德印, 張旭東. EXCEL與多元統(tǒng)計(jì)分析[M]. 北京: 中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社, 2007: 250-261.

[6] 周曉媛, 鄧靖, 李福枝. 發(fā)酵辣椒的揮發(fā)性風(fēng)味成分分析[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2007, 26(1): 54-59.

[7] 高惠璇. 應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 2006: 189-193.

[8] JOHNSON R A, WIEHERN D W. Applied multivariate statistical analysis[M]. London: Prentice Hall, 2001: 235-256.

[9] 尹建軍, 饒靜. 多變量統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)在白酒風(fēng)味特征研究中的應(yīng)用[J]. 釀酒科技, 2010(11): 57-60.

[10] 范成有. 香料及其應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 1990: 81-95.

[11] 吳謀成. 食品分析與感官評(píng)定[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2004: 55-56.

[12] 尹顯洪. 醇類香料的合成及其結(jié)構(gòu)與香氣特征的關(guān)系[J]. 廣西民族學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 2(1): 74-78.

[13] LI Yonghong. Cetal (Ketal) perfume and its development of synthesis studies[J]. 滁州學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 9(6): 57-62.

[14] 孫國(guó)寶. 食用調(diào)香術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2003: 690-740.

[15] 吳元鋒, 鄒禮根, 李亞飛. 純種接種生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)泡菜的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(4): 175-177.

Volatile Analysis of Chili Fermented by DifferentLactobacillusSpecies

HAN Jiang-xue，DING Zhu-hong*，LI Zhong-jun，HUANG Wei-xing

(College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

To better understand the effect of artificial inoculation on the flavor characteristics of fermented chili, SPME-GCMS was used to analyze the flavor composition of different types of fermented chili (natural fermentation and inoculated fermentation with 4 differentLactobacillusspecies). A total of 191 volatile flavor compounds were found belonging to 20 categories. Chili fermented by different strains contained very different types and amounts of volatile flavor compounds.Seventy-six flavor compounds (15 categories) were found inLactobacillus fermentumfermented chili, 20 (8 categories) in Streptococcus lactis fermented chili, 84 (13 categories) inLactobacillus plantarum, and 73 (11 categories) in Pediococcus acidilactici fermented chili. The results of principal component analysis (PCA) indicated that the comprehensive scores for volatile flavor compounds in chilis fermented by inoculation ofLactobacillus fermentum,Pediococcus acidilactici,Lactobacillus plantarumorStreptococcus lactisor naturally fermented were 11.28, 3.65,－ 0.08, － 11.30 and － 3.56, respectively. Five kinds of chili could be ranked in decreasing order of comprehensive score for volatile flavor compounds as follows:Lactobacillus fermentum>Pediococcus acidilactici＞Lactobacillus plantarum＞natural fermentation＞Streptococcus lactis. Fermented chili prepared by artificial inoculation had more outstanding flavor quality than naturally fermented chili.

Lactobacillus；fermented chili；solid phase micro-extraction-gas chromatograhy-mass spectrometry (SPMEGC-MS)；principal component analysis (PCA)

TS207.3

A

1002-6630(2012)10-0179-05

2011-05-17

多功能生物菌劑制備及其在發(fā)酵辣椒生產(chǎn)中應(yīng)用研究項(xiàng)目([2010]筑科農(nóng)合同字第1-農(nóng)-19號(hào))；

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2011]2156號(hào))

韓江雪(1986—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc貯運(yùn)保鮮技術(shù)。E-mail：hjxbjc@sohu.com

*通信作者：丁筑紅(1966—)，女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail：gzdxdzh@163.com