孟憲軍，劉 欣，馮 穎*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

回流提取長(zhǎng)白楤木嫩芽皂苷、黃酮工藝研究

孟憲軍，劉 欣，馮 穎*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

根據(jù)中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用響應(yīng)面分析法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別對(duì)回流法提取長(zhǎng)白楤木中的皂苷與黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：回流法提取長(zhǎng)白楤木中皂苷的最優(yōu)工藝參數(shù)組合為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1:65.3(g/mL)、時(shí)間2h、溫度94.1℃，預(yù)測(cè)皂苷最大提取量為74.65mg/g，實(shí)際測(cè)得皂苷最大提取量為70.25mg/g；回流法提取長(zhǎng)白楤木中黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)組合為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1:60(g/mL)、時(shí)間4h、溫度100℃，預(yù)測(cè)最大提取量為20.56mg/g，實(shí)際測(cè)得最大提取量為19.86mg/g。

長(zhǎng)白楤木；回流提??；皂苷；黃酮；響應(yīng)面法

長(zhǎng)白楤木(Aralia continentalis)屬五加科楤木屬，又名草本龍芽，草本刺老芽，東北土當(dāng)歸。在其根、莖、葉、花和果實(shí)中還含有豐富的皂苷、黃酮、木質(zhì)素、生物堿、揮發(fā)油等成分[1-4]。具有醫(yī)藥功效，歷代本草記載有“楤木，治水瘤、除風(fēng)疾”，“補(bǔ)腰腎、壯筋骨[5-6]”，是一種集營(yíng)養(yǎng)保健和治療于一身的天然保健食品。

近年來許多研究機(jī)構(gòu)都著手于長(zhǎng)白楤木根莖中的功能成分的研究[7]，關(guān)于其嫩芽中的皂苷、黃酮報(bào)道比較少見。而通過對(duì)一些資料的研究發(fā)現(xiàn)其嫩芽中的皂苷、黃酮總量數(shù)目也相當(dāng)可觀[8-9]，因此本實(shí)驗(yàn)著以長(zhǎng)白楤木嫩芽為原料采用熱回流提取方法，研究提取過程中提取液濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)提取量的影響，通過響應(yīng)面分析方法優(yōu)化皂苷、黃酮提取工藝[10-1 1]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

長(zhǎng)白楤木 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院；無水乙醇、香草醛冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、亞硝酸鋁均為分析純。

索氏提取器；電熱恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；UV-1600紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 皂苷和黃酮的提取

取1g干燥粉碎后的長(zhǎng)白楤木嫩芽粉末，用濾紙包好，放入索氏提取器樣品室內(nèi)，加入一定量一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取劑，水浴加熱回流提取一定時(shí)間后，收集提取液，過濾，將濾液收集至容量瓶中，用相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的提取液定容至100mL。

1.2.2 皂苷和黃酮含量的測(cè)定

按照文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定其對(duì)熱回流提取皂苷、黃酮的影響關(guān)系。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用B o x-Behnken設(shè)計(jì)法(表1)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)(采用真實(shí)值代碼)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。模型通過最小二乘法擬合，二次多項(xiàng)方程可表達(dá)為：Y＝A0＋∑AiXi＋∑AiiXi＋∑AijXiXj。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 原料粉碎粒度對(duì)提取量的影響

圖1 顆粒粒度對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of particle size on extraction rate of saponins and flavonoids

從圖1可以看出，皂苷得率高于黃酮，而且原料粉碎粒度在過20～60目篩范圍內(nèi)，隨著粉碎粒度的減小皂苷、黃酮得率逐漸增大，而在過80目篩后得率反而降低。原因可能是粉碎粒度太細(xì)導(dǎo)致原料表面張力增大，不利于有效成分的溶出。故原料粉碎粒度選擇過60目篩為宜。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of saponins and flavonoids

由圖2可知，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取劑沸點(diǎn)越來越低，達(dá)到回流越來越容易，多次的回流使物料與提取液充分接觸，提高了提取量[12]。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到95%時(shí)，皂苷提取量不再增加，而黃酮提取量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。說明二者的極性并不同，黃酮的極性更大，而95%乙醇極性較小不利于黃酮的提取。2.1.3 料液比對(duì)提取量的影響

圖3 料液比對(duì)提取量的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of saponins and flavonoids

由圖3可知，隨提取劑體積的增加，皂苷和黃酮的提取量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。其中皂苷提取量受到的影響更大。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of saponins and flavonoids

由圖4可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)，提取劑回流次數(shù)越多，提取室內(nèi)提取劑與物料接觸時(shí)間長(zhǎng)提取效果好[13]。當(dāng)時(shí)間達(dá)到一定程度后，提取量趨于穩(wěn)定。由圖可知在3h后提取基本充分。

2.1.5 提取溫度對(duì)提取量的影響

圖5 提取溫度對(duì)提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of saponins and flavonoids

由圖5可知，溫度升高提取量會(huì)逐漸增大，因?yàn)闇囟仍礁咛崛┓序v的越快。越容易進(jìn)入到提取室中與物料接觸進(jìn)行提取。但由圖中可以看出皂苷的熱穩(wěn)定性比較差，在高溫下容易分解，所以提取溫度不宜過高。2.2 擬合模型的建立及方差分析

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests

對(duì)表2進(jìn)行回歸分析，獲得皂苷和黃酮提取的二次多元回歸方程分別為：

2.2.1 皂苷提取擬合模型的建立及方差分析

表3 皂苷提取回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the developed regression equation for saponins

從表3可看出，回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間關(guān)系時(shí)，起因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著。失擬項(xiàng)大于0.05不顯著，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好，可以反映出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表4 皂苷提取回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significant test of regression coefficients

從表4可以看出，除時(shí)間一次項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)二次項(xiàng)、時(shí)間與溫度交互項(xiàng)不顯著外，其他各項(xiàng)均呈顯著或極顯著的關(guān)系。表明該方程不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互作用影響很大。與模型檢驗(yàn)結(jié)果相符合。

2.2.2 黃酮提取擬合模型的建立及方差分析

表5 黃酮提取回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of the developed regression equation for flavonoids

從表5可看出，回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間關(guān)系時(shí)，起因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著。失擬項(xiàng)大于0.05不顯著，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好，可以反映出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表6 黃酮提取回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significant test of regression coefficients

從表6可以看出，溫度對(duì)黃酮提取量的影響極顯著，時(shí)間的二次項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與時(shí)間、時(shí)間與溫度交互作用極顯著，料液比與時(shí)間交互作用影響顯著，與模型檢驗(yàn)結(jié)果相符合，交互作用影響很大。

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析

如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度相對(duì)平緩，表明其可以忍受處理?xiàng)l件的變異，而不影響到相應(yīng)值的大小，相反，如果一個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[14-15]。

圖6 各兩因素交互作用對(duì)皂苷提取量的影響Fig.6 The effect of cross-interaction among factors on extraction rate of saponins

圖7 各兩因素交互作用對(duì)黃酮提取量的影響Fig.7 The effect of cross-interaction among factors on extraction rate of flavonoids

從圖6a和圖7a可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷和黃酮提取量的影響均受到料液比交互作用的影響。當(dāng)料液比較小時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高提取量均增大；而當(dāng)料液比較大時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，皂苷提取量變化不大，黃酮提取量則下降。由圖6b和圖7b可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷和黃酮提取量的影響均受到提取時(shí)間交互作用的影響。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，隨提取時(shí)間增大，提取量均增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較大時(shí)，隨時(shí)間增加，皂苷提取量先下降后上升，而黃酮提取量則呈下降趨勢(shì)。由圖6c和圖7c可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷、黃酮提取量的影響不受提取溫度的影響，無論乙醇體積分?jǐn)?shù)怎樣變化，隨溫度的增加，皂苷提取量都呈先增加后降低的趨勢(shì)，而黃酮提取量都是呈上升的趨勢(shì)。由圖6d和圖7d可知，料液比對(duì)皂苷和黃酮提取量的影響均受提取時(shí)間交互作用的影響，且變化趨勢(shì)一致。即提取時(shí)間較短時(shí)，隨料液比增大，提取量增加；提取時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，隨料液比增加，提取量下降。由圖6e可知，提取溫度對(duì)皂苷提取量的影響受料液比的交互作用影響。當(dāng)料液比較小時(shí)，隨提取溫度的增加，提取量增加。當(dāng)料液比較大時(shí)，隨提取溫度的增加，提取量先上升再下降，在90℃處達(dá)到最大值。由圖7e可知，隨溫度的升高，黃酮提取量不斷升高，料液比的交互作用影響較小。由圖6f可知，隨著提取溫度的升高皂苷先上升后下降，受到提取時(shí)間的交互影響作用較小。由圖7f可知，提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響受提取溫度交互作用的影響。當(dāng)提取溫度較低時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量降低。當(dāng)提取溫度較高時(shí)，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量升高。

2.2.4 提取工藝優(yōu)化及驗(yàn)證

通過軟件Design-Expert求解方程，得到優(yōu)化的皂苷提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1:65.3、時(shí)間2h、溫度94.1℃，預(yù)測(cè)結(jié)果為74.65mg/g?？紤]實(shí)際操作條件分別選擇參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1:65、時(shí)間2h、溫度94℃進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得平均值為70.25mg/g。

得到優(yōu)化的黃酮提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1:60、時(shí)間4h、溫度100℃，預(yù)測(cè)結(jié)果為20.56mg/g。按照上述操作條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得平均值為19.86mg/g。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面分析法分別研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比，回流提取時(shí)間、提取溫度及其相互間的交互作用對(duì)回流法提取長(zhǎng)白楤木中的皂苷、黃酮的影響效果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各因素及其相互間的交互作用對(duì)兩種活性成分提取效果的影響并不完全相同，特別是交互作用的影響差異較大。

采用熱回流方法來提取長(zhǎng)白楤木中的皂苷、黃酮，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化，得出皂苷最優(yōu)提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1:65.3、時(shí)間2h、溫度94.1℃，預(yù)測(cè)結(jié)果為74.65mg/g。此條件下皂苷提取率為70.25mg/g，符合率達(dá)94.10%。黃酮最優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1:60、時(shí)間4h、溫度100℃，預(yù)測(cè)結(jié)果為20.56mg/g。此條件下黃酮提取率為19.86mg/g，符合率達(dá)96.59%。

[1] 馮穎, 李天來, 范文麗, 等. 長(zhǎng)白楤木生物活性成分的初步研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009(5): 256-258.

[2] 范文麗, 侯德明, 趙英明. 藥食兼用野生植物資源長(zhǎng)白楤木研究概述[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(6): 47-48.

[3] 王廣樹, 陳燕平, 徐景達(dá). 長(zhǎng)白楤木根揮發(fā)油成分的研究[J]. 人參研究, 1991(1): 32-33.

[4] 杜鳳國(guó), 姜炳文, 胡榮. 長(zhǎng)白楤木揮發(fā)油成分分析[J]. 植物研究, 2001(1): 110-112.

[5] 李時(shí)珍. 本草綱目: 第二冊(cè)[M]. 北京: 人民出版社, 1977.

[6] 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典:下[M]. 上海: 上海人民出版社, 2005.

[7] 李寶仁, 楊立學(xué), 程政軍. 長(zhǎng)白楤木研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)科技信息, 2006,23(2): 56-57.

[8] HAN G J, SHIN D S, JANG M S. A Study of the nutritional composition ofAralia continentalisKitagawa andAralia cotinentalisKitagawa Leaf[J]. Korean Journal fo Food science and Technology, 2008, 40(6):69-72.

[9] KIM J S, KANG S S, CHOI J S, et al. Antioxidant components from Aralia continentalis[J]. Korean Journal of Pharmacognosy, 1998, 29(1):178-179 .

[10] NIE W, LUO J G, WANG X B, et al. An insight into enrichment and separation of oleanane-type triterpenoid saponins by various chromatographic materials[J]. Separation and Purification Technology, 2009, 65(3): 93-95.

[11] LI Yongdi, YAO Yadong, SHAO Wei, et al. Preparation of titanium carbonitride nanoparticles from a novel refluxing-derived precursor[J].Materials Letters, 2009, 63(22): 112-114.

[12] 韓本勇. 仙人掌總皂苷提取純化工藝的研究[D]. 昆明: 昆明理工大學(xué), 2008.

[13] 肖衛(wèi)華, 韓魯佳. 黃芪黃酮乙醇回流提取工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(1): 233-235.

[14] 陳莉, 屠康, 王海, 等. 采用響應(yīng)曲面法對(duì)蔡侯紅富士蘋果熱處理?xiàng)l件的優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2006, 22(2): 159-163.

[15] DING Youliang, LI Aiqun, DENG Yang. A new look at the response surface method for reliability analysis using chaos theory[J]. Eerthouake Engineering and Engineering Bibration, 2008(7): 329-335.

Optimization of Refluxing Extraction for Saponins and Flavonoids fromAralia continentalis

MENG Xian-jun，LIU Xin，F(xiàn)ENG Ying*

(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

On the basis of single factor tests, response surface methodology based on Box-Behnken design principle was used to optimize the process parameters of refluxing extraction for saponins and flavonoids fromAralia continentalis, respectively.Results showed that the optimal extraction conditions for saponins were ethanol concentration of 80%, material-liquid ratio of 1:65 (g/mL), extraction time of 2 h and extraction temperature of 94.1 ℃; the optimal extraction conditions for flavonoids were ethanol concentration of 60%, material-liquid ratio of 1:60, extraction time of 4 h and extraction temperature of 100 ℃. The yields of saponins and flavonoids were 74.65 mg/g and 19.86 mg/g, respectively, which were consistent with the predicted values of 70.25 mg/g and 20.56 mg/g.

Aralia continentalis；refluxing saponins；flavonoids；response surface methodology

R284.2

A

1002-6630(2012)10-0051-06

2011-05-31

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31000803)

孟憲軍(1960—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣呒庸ぁ-mail：mengxjsy@126.com

*通信作者：馮潁(1975—)，女，副教授，博士后，研究方向?yàn)楣呒庸?。E-mail：fywjg@sina.com