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        響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃蛋白水解及多肽的抗氧化研究

        2012-10-25 03:57:48劉長(zhǎng)江賈莎莎許金光
        食品科學(xué) 2012年10期
        關(guān)鍵詞:軟棗多肽堿性

        劉長(zhǎng)江,賈莎莎,許金光

        (沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽 110866)

        響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃蛋白水解及多肽的抗氧化研究

        劉長(zhǎng)江,賈莎莎,許金光

        (沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧 沈陽 110866)

        以酶解產(chǎn)物清除羥基自由基能力為指標(biāo),選用堿性蛋白酶為水解酶,利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化軟棗獼猴桃蛋白最佳酶解工藝條件并制取抗氧化肽??疾炱渌舛群颓宄实南嚓P(guān)性。結(jié)果表明:堿性蛋白酶最佳酶解工藝為溫度50℃、pH9、加酶量4000U/g、酶解時(shí)間3h,此時(shí)水解度達(dá)到最大值為25.08%。在此條件下將軟棗獼猴桃蛋白分別水解1、2、3、4、5h得到肽混合物進(jìn)行抗氧化活性分析,得到其對(duì)羥自由基清除率分別為18.69%、24.67%、28.04%、25.82%、26.65%。當(dāng)酶解時(shí)間為3h時(shí),此時(shí)抗氧化肽的羥自由基清除率最高。

        軟棗獼猴桃;抗氧化肽;水解度;清除率

        軟棗稱猴桃(Actinidia argutaSieb.et Zucc.),別名軟棗子,主要分布在東北、華北、山東、西北及長(zhǎng)江流域,其中,東北南部山區(qū)較多見[1]。是大藤木,皮淡灰褐色,片裂,葉互生,稍厚革質(zhì)或紙質(zhì),卵圓形,其果實(shí)無污染、口感好,為營(yíng)養(yǎng)豐富的保健食品和老弱病人的療效食品,是具有開發(fā)前景的第3代水果之一[2]。棗獼猴桃中含有蛋白質(zhì)、糖類、黃酮類、維生素、氨基酸、礦質(zhì)元素等多種功能活性成分[3],對(duì)軟棗獼猴桃的研究報(bào)道也越來越多[4-6]。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì), 很早以前就有報(bào)道稱肽可被完整吸收進(jìn)入血液,對(duì)機(jī)體的功能和狀態(tài)起到積極作用,有利于機(jī)體健康[7-8]。近年來,通過酶法水解來提高蛋白食品的加工性能、營(yíng)養(yǎng)性以及釋放出生理保健功能的多肽已經(jīng)受到廣泛重視。人們發(fā)現(xiàn)小肽在人體吸收代謝過程中具有重要生理功能,如參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、降血壓、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收及抗血栓等[9-10]。蛋白質(zhì)酶解可以生成小分子質(zhì)量的肽類,不但提高了原蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而且具有抗氧化、降血壓、抗菌等多種活性,其中抗氧化性更是科研工作者研究的熱點(diǎn)[11]。劉立芳等[12]利用中性蛋白酶酶解小麥蛋白,得到了具有較強(qiáng)的抗氧化活性的多肽。目前食品工業(yè)中使用的抗氧化劑多數(shù)為人工合成,隨著人們對(duì)食品添加劑安全性的關(guān)注不斷提高,篩選具有抗氧化活性的天然資源已成為食品科學(xué)研究的新趨勢(shì)[13]。因此,開發(fā)軟棗獼猴桃蛋白多肽及其研究制取工藝具有一定的臨床意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

        本實(shí)驗(yàn)根據(jù)酶水解原理和響應(yīng)曲面統(tǒng)計(jì)法(response surface methodology,RSM)對(duì)制取軟棗獼猴桃蛋白多肽的工藝進(jìn)行研究[14]。以水解度(degree of hydrolysis,DH)為衡量指標(biāo),并以酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH值為4因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),同時(shí)對(duì)酶解產(chǎn)物清除羥基自由基的能力進(jìn)行分析。為軟棗獼猴桃蛋白的優(yōu)化水解提供一定的基礎(chǔ),也為研究一定功能的活性肽和功能食品基料提供一定理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        軟棗獼猴桃粗蛋白(自制,粗蛋白含量23.35%);堿性蛋白酶、2-脫氧-D-核糖 美國(guó)Sigma公司;甘氨酸、茚三酮、三氯乙酸、硫代巴比妥酸等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        PB-10 pH酸度計(jì) 德國(guó)Sartorius 公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;HD-5電腦紫外檢測(cè)儀 上海滬西分析儀器廠;高速冷凍離心機(jī)。

        1.3 方法

        1.3.1 軟棗獼猴桃蛋白的提取工藝

        工藝流程:軟棗獼猴桃鮮果→勻漿→加水、調(diào)pH8,45℃水浴2h→離心(6000r/min、15min)→取上清液→調(diào)pH值,靜置→離心取沉淀,水洗至中性→冷凍干燥得軟棗獼猴桃粗蛋白。

        1.3.2 軟棗獼猴桃蛋白多肽的制備工藝流程

        自制軟棗獼猴桃粗蛋白→加水→加熱處理(30min、70℃)→冷卻→調(diào)pH值,加酶液→恒溫水解(50℃)→冷卻至室溫→滅酶(70℃、5min)→離心(4000r/min)→軟棗獼猴桃蛋白水解液(軟棗獼猴桃蛋白多肽)

        1.3.3 氨基酸態(tài)氮測(cè)定

        采用茚三酮顯色法[15]。

        1.3.4 水解度的計(jì)算[16]

        取樣品溶液1mL,加入pH5.4的醋酸緩沖溶液和茚三酮顯示液各1mL混勻后,在100℃沸水水浴15min后,自來水冷卻。放置5min后,加入3mL 60%乙醇溶液稀釋,搖勻后在570nm處測(cè)吸光度。將

        吸光度與甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照,得出氨基酸態(tài)氮含量。

        式中:AN為水解液中氨基酸態(tài)氮的含量/%;TN為原料中粗蛋白總氮的含量/%。

        1.3.5 單因素試驗(yàn)

        蛋白酶解一般受到加酶量、酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間等影響。本試驗(yàn)將軟棗獼猴桃蛋白與蒸餾水按一定比例溶解,初始提取條件為加酶量4000U/g、pH9、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3h,在此基礎(chǔ)上測(cè)定不同單因素條件下,軟棗獼猴桃蛋白酶解水解度的變化。

        單因素水平:加酶量2000、3000、4000、5000、6000U/g;酶解溫度30、40、50、60、70℃;pH7、8、9、1 0、1 1;酶解時(shí)間1、2、3、4、5 h。

        1.3.6 堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白的響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)

        根據(jù)單因素試驗(yàn),選取影響酶解效果的酶解時(shí)間、溫度、pH值、加酶量4個(gè)因素。利用Minitab 15軟件,采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),以蛋白質(zhì)的水解率為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定堿性蛋白酶提取軟棗獼猴桃蛋白多肽的最優(yōu)條件,試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

        表1 堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白的響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

        1.3.7 軟棗獼猴桃蛋白多肽清除羥自由基的測(cè)定[17-20]

        為測(cè)定軟棗獼猴桃蛋白多肽清除羥自由基的能力,利用Feton體系產(chǎn)生的羥自由基,通過分析自由基對(duì)2-脫氧-D-核糖分子的氧化、破壞情況來確定樣品的存在是否對(duì)羥基自由基具有清除作用,保護(hù)2-脫氧-D-核糖分子不被羥自由基氧化、破壞。具體測(cè)定方法:取0.2mL FeSO4-EDTA混合液(10mmol/L)于試管中,加入0.05mL 2-脫氧-D-核糖溶液(10mmol/L),然后加適量軟棗獼猴桃蛋白多肽,用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)定容至1.8mL,再加入0.2mL H2O2(10mmol/L),混合后置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)1h,然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.8%的三氯乙酸(TCA)溶液1.0mL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL,混勻,置沸水浴反應(yīng)15min,冷卻后用在波長(zhǎng)532nm處測(cè)吸光度。對(duì)照管除不加酶解液外,其余相同,所測(cè)吸光度(A0),空白管以磷酸緩沖液調(diào)零,用清除率表示清除能力。式中:A0為不加酶液測(cè)的空白值;A為樣品的吸光度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 堿性蛋白酶提取軟棗獼猴桃蛋白抗氧化肽的單因素試驗(yàn)

        2.1.1 加酶量對(duì)水解度的影響

        圖1 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

        由圖1可知,隨著加酶量的增加,軟棗獼猴桃蛋白水解度逐漸升高。當(dāng)加酶量達(dá)到一定程度時(shí),大部分蛋白酶解,此后隨著加酶量的增大,水解度無顯著提高。堿性蛋白酶在水解軟棗獼猴桃蛋白時(shí),在加酶量4000U/g時(shí),軟棗獼猴桃蛋白多肽水解度的上升趨勢(shì)趨于平緩,則確定堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適加酶量為4000U/g。

        2.1.2 pH值對(duì)水解度的影響

        圖2 pH值對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis

        由圖2可知,pH值對(duì)水解效果的影響顯著。堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白時(shí),pH值從7增加到9時(shí),蛋白水解度逐漸增大;而當(dāng)pH值從9增加到11時(shí),軟棗獼猴桃蛋白的水解度逐漸減小,pH值為9時(shí)水解度達(dá)到最高。因此,確定堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適pH值為9。

        2.1.3 溫度對(duì)水解度的影響

        圖3 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

        從圖3可知,酶解溫度對(duì)水解效果的影響顯著。堿性蛋白酶在水解軟棗獼猴桃蛋白時(shí),溫度從30℃增加到50℃,軟棗獼猴桃蛋白水解度升高顯著,且升趨勢(shì)明顯;而當(dāng)溫度繼續(xù)升高,則蛋白提取率逐漸下降,溫度50℃時(shí)酶解得到的軟棗獼猴桃蛋白水解度達(dá)到最高。因此,確定堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適溫度為50℃。

        2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

        圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

        從圖4可以看出,酶解時(shí)間對(duì)水解度有一定影響。酶解軟棗獼猴桃蛋白時(shí),隨時(shí)間的延長(zhǎng),軟棗獼猴桃多肽的水解度逐漸增多,當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后,軟棗獼猴桃多肽的水解度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而趨于平緩。這是因?yàn)殡S著酶解的進(jìn)行,軟棗獼猴桃蛋白含量逐漸減少。堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白時(shí),3h以后,水解度變化逐漸趨于平緩,因此,選擇堿性蛋白酶水解軟棗獼猴桃蛋白的最適時(shí)間是3h。

        2.2 酶解軟棗獼猴桃蛋白的響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

        2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

        在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,以相關(guān)性密切的4個(gè)因素

        酶解溫度、加酶量、pH值和酶解時(shí)間為自變量,水解度為響應(yīng)值對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析表見表2。

        表2 軟棗獼猴桃蛋白酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests

        根據(jù)表2結(jié)果,利用Minitab 15軟件分析得到軟棗獼猴桃蛋白的水解度對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)式回歸模型為:Y=25.05-0.41A-0.47B-0.337C+0.37D-0.52AB+0.29AC+0.69AD+0.89BC-0.08BD-0.12CD-1.26A2-2.12B2-3.28C2-5.53D2。

        表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression model

        表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance test for each item in the regression model

        由表3、4可知,該模型的預(yù)測(cè)系數(shù)為R2(預(yù)測(cè)決定系數(shù))=0.9469,相對(duì)于校正決定系數(shù)R2Adj=0.9799擬合度好,決定系數(shù)為R2=0.9907,說明該模型的擬合性非常好,可以用于模型分析。

        從表4可知,A、B、D、A D、B C、A2、B2、C2、D2差異極顯著;C、AB為顯著項(xiàng);BD、CD為不顯著項(xiàng)。失擬項(xiàng)的P=0.058,說明失擬項(xiàng)不顯著,模型的擬合性好。因此可利用該回歸模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析,確定軟棗獼猴桃蛋白水解的最佳工藝條件。2.2.2 響應(yīng)面分析及優(yōu)化

        圖5 各兩因素交互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of the cross-interaction among factors on the degree of hydrolysis

        由圖5可知,響應(yīng)面分析方法的圖形是特定的響應(yīng)面對(duì)應(yīng)的因素加酶量、時(shí)間、pH值、溫度構(gòu)成三維空間。響應(yīng)面分析圖上可以看出4因素值選擇合理,驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)的正確性。運(yùn)用 Minitab 軟件的響應(yīng)優(yōu)化器對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化,由二次多項(xiàng)回歸方程來預(yù)測(cè)堿性蛋白酶酶解軟棗獼猴桃蛋白多肽水解度最高的提取條件。經(jīng)過軟件分析得出最優(yōu)條件為pH8.9、加酶量3868.7U/g、酶解溫度50.3℃、酶解時(shí)間2.9h,該條件下軟棗獼猴桃蛋白多肽的水解度的預(yù)測(cè)值為該條件下軟棗獼猴桃蛋白多肽的水解度的預(yù)測(cè)值為25.12%。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)操作將預(yù)測(cè)條件優(yōu)化為pH9、加酶量4000U/g、酶解溫度50℃和酶解時(shí)間3h。

        2.3 軟棗獼猴桃蛋白多肽羥自由基清除能力

        以羥自由基清除率為衡量指標(biāo),采用酶解的最優(yōu)條件為加酶量4000U/g、pH9、酶解溫度50℃,分別測(cè)定酶解1、2、3、4、5h時(shí),軟棗獼猴桃蛋白多肽的羥自由基清除率,結(jié)果見表5。

        表5 羥自由基清除率Table 5 Hydroxyl radical-scavenging rates

        由表5可見,羥自由基清除率隨著酶解時(shí)間的增加而增大,當(dāng)水解3h時(shí)清除率達(dá)到最高值,而繼續(xù)酶解后清除率并沒有依次增高,這種現(xiàn)象可能是因?yàn)榫哂休^高的肽在接下來的反應(yīng)中被水解。綜合反應(yīng)來看,隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng),羥自由基的清除率有所上升,這是由于具有抗氧化活性的肽分子質(zhì)量一般較小[21]。在一定范圍內(nèi)水解時(shí)間越長(zhǎng),肽平均的分子質(zhì)量就會(huì)越小,可能具有抗氧化活性的肽就越多,因此在實(shí)驗(yàn)中水解4、5h時(shí)出現(xiàn)了較高的清除率。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)酶解3h時(shí)得到軟棗獼猴桃蛋白多肽的羥自由基清除率為28.04%,抑制率最高,同時(shí)水解度也達(dá)到了最高值25.08%。因此采用酶解3h作為制備抗氧化肽的最佳水解時(shí)間。

        3 結(jié) 論

        在水解軟棗獼猴桃蛋白制備抗氧化肽的工藝中,pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)水解度均有一定影響。通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)曲面分析方法,以水解度為衡量指標(biāo),確定了最優(yōu)提取工藝參數(shù)pH9、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間3h、加酶量4000U/g,在此條件下將軟棗獼猴桃蛋白分別水解1、2、3、4、5h得到肽混合物進(jìn)行抗氧化活性分析,得到其對(duì)羥自由基的清除率分別為18.69%、24.67%、28.04%、25.82%、26.65%。因此選擇3h作為水解制備抗氧化肽的時(shí)間,此時(shí)抗氧化肽的羥自由基清除率最高。

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        Optimization of Enzymatic Hydrolysis for Protein fromActinidia argutaSieb. et Zucc by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity of Polypeptides

        LIU Chang-jiang*,JIA Sha-sha,XU Jin-guang

        (College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

        Taking hydroxyl radical-scavenging capacity of hydrolysates as the index, the optimal hydrolysis process for the protein fromActinidia argutaSieb. et Zucc by alkaline protease was explored by response surface methodology (RSM) to prepare antioxidant polypeptides. Meanwhile, the correlation between the degree of hydrolysis (DH) and the hydroxyl radical-scavenging capacity of polypeptides was examined. The results showed that the optimal hydrolysis parameters of alkaline protease enzyme were hydrolysis temperature of 50 ℃, hydrolysis pH of 9, enzyme addition amount of 4000 U/g, and hydrolysis time of 3 h. Under the optimal hydrolysis condition, the DH was up to 25.08%. In addition, the hydroxyl radical-scavenging rates of the hydrolysis products from the protein ofActinidia argutasubjected to hydrolysis for 1, 2, 3, 4 h and 5 h at the optimal hydrolysis conditions were 8.69%, 24.67%, 28.04%, 25.82% and 26.65%. The product achieved at 3 h hydrolysis revealed the strongest hydroxyl radical-scavenging rate.

        Actinidia argutaSieb. et Zucc;anti-oxidant peptides;hydrolysis degree;clearance rate

        TS255.36

        A

        1002-6630(2012)10-0033-06

        2011-05-17

        國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(200903013)

        劉長(zhǎng)江(1955—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:liucj597@sohu.com

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