郭元新，楊潤強，陳 惠，宋 玉，顧振新,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

鹽脅迫富集發(fā)芽大豆γ-氨基丁酸的工藝優(yōu)化

郭元新1,2，楊潤強1，陳 惠1，宋 玉1，顧振新1,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；2.安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面試驗研究氯化鈉濃度、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度對大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的影響，目的是優(yōu)化鹽脅迫條件下發(fā)芽大豆富集GABA的最佳培養(yǎng)條件。研究結(jié)果表明：豆芽在鹽脅迫條件下富集GABA的最優(yōu)條件是氯化鈉濃度133.5mmol/L、培養(yǎng)時間5.5d、培養(yǎng)溫度33.3℃，在此條件預測的最高GABA富集量為1205.24μg/g。方差分析和驗證實驗顯示，模型可準確的預測鹽脅迫條件下大豆發(fā)芽過程中GABA的富集。

大豆；發(fā)芽；鹽脅迫；γ-氨基丁酸富集；響應(yīng)面試驗

在中國及亞洲，發(fā)芽大豆作為人類的食物已有2000多年的歷史。作為一種健康和時尚產(chǎn)品，豆芽在歐洲各國飲食生活中的重要性與日俱增[1]。大豆(Glycine maxL.)是一種質(zhì)優(yōu)價廉的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)來源。眾多研究表明，種子發(fā)芽過程中發(fā)生了大量復雜的生理生化變化[2-4]，種子中的酶不斷產(chǎn)生或被激活，一些大分子物質(zhì)如淀粉和蛋白質(zhì)被分解?？刂瓢l(fā)芽條件，還可生成和富集γ-氨基丁酸(γaminobutyric acid，GABA)等[3,5]大豆中原來含量低或不具有的功能成分。

GABA是一種以自由態(tài)廣泛存在于原核生物和真核生物中的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸。因為GABA具有降血壓，改善腦機能和緩解疼痛和焦慮等作用，富含GABA的食品近年來備受消費者歡迎[5-6]。已有的研究表明，植物中GABA的合成主要受GABA支路和多胺降解的影響，其中谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)和二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO，EC 1.4.3.6)分別是這兩條途徑中的限速酶[7-8]。

植物在熱擊、冷害、鹽脅迫、機械刺激和低氧等脅迫條件下能夠強烈的激活GAD和DAO的酶活性，從而導致GABA的積累[7,9]，其中鹽脅迫是一種安全，環(huán)保的脅迫方式。盡管目前已有學者研究了不同發(fā)芽條件下[1,10-11]、CO2處理[12]、低氧脅迫[13]和谷氨酸鈉等條件[14]對大豆芽菜GABA富集的影響，但在發(fā)芽過程中應(yīng)用鹽脅迫的方式促進豆芽GABA的富集，目前還沒有見到相關(guān)的報道。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化鹽脅迫條件下發(fā)芽大豆富集GABA的最優(yōu)工藝條件，為芽菜科學和大豆資源的開發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

Orion818型pH測試儀 美國Orion公司；1200型液相色譜儀 美國Agilent公司；TDL-40B型離心機 上海安亭科學儀器廠；DZF-6020型真空干燥器 上海一恒科技有限公司；PYX-DH-CBS型隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；真空冷凍干燥系統(tǒng) 美國Labconce公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗

大豆種子用去離子水清洗后，用1%的次氯酸鈉溶液消毒15min，用去離子水沖洗至pH值中性，于去離子水中30℃浸泡4h。置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，每8h噴氯化鈉溶液(脅迫處理)或去離子水(對照)一次，于生化培養(yǎng)箱中暗發(fā)芽，具體操作如下：(1)樣品分別置于20、25、30、35℃的培養(yǎng)箱內(nèi)暗發(fā)芽，期間以100mmol/L氯化鈉溶液進行鹽脅迫處理；(2)樣品分別用0、50、10、150mmol/L的氯化鈉脅迫處理，發(fā)芽溫度30℃；(3)樣品用100mmol/L 氯化鈉溶液進行脅迫處理，分別培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6d后取樣測定其GABA含量。試驗結(jié)束后，所有樣品用去離子水清洗后用吸水紙吸干水分，液氮速凍后真空冷凍干燥，隨后粉碎至過8 0目篩，待測。

1.3.2 Box-Behnken設(shè)計

表1 大豆發(fā)芽富集GABA的培養(yǎng)條件響應(yīng)面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化大豆發(fā)芽富集GABA的培養(yǎng)條件，每個處理重復3次。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取氯化鈉濃度(X1)、培養(yǎng)時間(X2)和培養(yǎng)溫度(X3)作為研究對象(表1)，整個設(shè)計包括5個中心點共17個組合。以GABA含量(Y)作為響應(yīng)值。優(yōu)化結(jié)果將得出一個響應(yīng)值(Y)與變量(Xi)間的二元多項回歸模型。

1.3.3 GABA含量的測定

唐玄奘，前世為如來二弟子金蟬子，法號“玄奘”，被尊稱為“三藏法師”，后世俗稱“唐僧”，受大唐皇帝之托組建取經(jīng)四人組，從東土大唐出發(fā)，到西天拜佛求取真經(jīng)。唐僧作為整個取經(jīng)團隊的領(lǐng)袖，負責整個團隊的經(jīng)營和管理，和車間主任的崗位較為相似。每天要掌控車輛的維修進度，協(xié)調(diào)車間的日常管理工作，對那些不聽話的人員不時還要念念“緊箍咒”。當然除了管理之外還要配合其他部門完成相應(yīng)工作，關(guān)心自己團隊人員的工作與生活困難，遇到問題時還要幫忙解決。總的來說唐僧的工作比較繁瑣，需要由膽大心細、有責任心的人來做。

G A B A測定采用高壓液相色譜法，色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA reversed-phase column(3.5μm)，4.6mm×150mm，條件參照Guo等[13]的方法。

1.3.4 統(tǒng)計分析

試驗設(shè)3次重復，結(jié)果以“x－±s”表示。響應(yīng)面設(shè)計及分析采用Design Expert軟件(Version7.0.0，Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫條件下發(fā)芽溫度對發(fā)芽大豆GABA富集的影響

圖1 鹽脅迫條件下溫度對發(fā)芽大豆GABA富集的影響Fig.1 Effect of temperature on GABA accumulation in germinated soybean under salt stress

如圖1所示，發(fā)芽至2d時，在35℃的培養(yǎng)溫度、鹽脅迫處理條件下豆芽中GABA含量(以干質(zhì)量計，下同)達556.12μg/g，分別為30、25、20℃條件下的1.06、1.17、1.47倍；發(fā)芽至3d時，鹽脅迫處理組GABA含量則達765.13μg/g，分別為1.04、1.32、1.77倍，對照處理也呈現(xiàn)了相同的趨勢。另外，大豆發(fā)芽至2d時，20～35℃各溫度條件下，鹽脅迫組GABA含量分別是非脅迫組的1.25、1.15、1.14倍和1.09倍，發(fā)芽至3d時則達到1.22、1.34、1.37倍和1.19倍。可見，在20～35℃溫度范圍內(nèi)，溫度越高越有利于豆芽積累GABA，各處理間差異極顯著(P＜0.01)，且鹽脅迫環(huán)境有利于GABA的富集。

2.2 氯化鈉濃度對發(fā)芽大豆GABA富集的影響

圖2 氯化鈉濃度對發(fā)芽大豆GABA富集的影響Fig.2 Effect of NaCl content on GABA accumulation in germinated soybean under salt stress

由圖2可見，在同一發(fā)芽時點上，不同的氯化鈉濃度對豆芽GABA的富集均有極顯著影響(P＜0.01)。濃度在0～100mmol/L變化時，豆芽中GABA含量升高，發(fā)芽5d后GABA含量達1121.8μg/g ，是對照(0mmol/L)處理的1.35倍，是原料的7倍(數(shù)據(jù)未顯示)。當氯化鈉濃度高于100mmol/L時，豆芽中GABA含量則呈下降的趨勢，然而發(fā)芽1d和3d時，100mmol/L和150mmol/L的氯化鈉處理間并未顯著差異(P＜0.05)。

2.3 鹽脅迫條件下發(fā)芽時間對發(fā)芽大豆GABA富集的影響

圖3 培養(yǎng)時間對發(fā)芽大豆GABA富集的影響Fig.3 Effects of culture time on GABA accumulation in germinated soybean

如圖3所示，培養(yǎng)時間對豆芽中GABA的富集具有極顯著影響(P＜0.01)。在鹽脅迫條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，豆芽中的GABA富集量逐步增長，在5d時達到最大值1145.5μg/g，是對照發(fā)芽5d后的1.40倍，是發(fā)芽前的4.4倍。發(fā)芽5d后，豆芽中GABA的富集有下降的趨勢。

2.4 Box-Behnken試驗模型的建立與方差分析

響應(yīng)面設(shè)計和相應(yīng)的試驗數(shù)據(jù)見表2。用多元統(tǒng)計分析結(jié)果顯示響應(yīng)面的實驗結(jié)果符合二次回歸公式。描述GABA產(chǎn)量與各自變量關(guān)系的多項式公式如下：

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experimental results for GABA content from germinated soybean

表3 回歸方程各項的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for the regression equation

統(tǒng)計分析結(jié)果(表3)顯示所建立的模型顯著，決定系數(shù)(R2)為0.9724，測定值與預測值之間有極高的擬合度。對回歸模型進行方差分析，F(xiàn)值為19.57，回歸模型極其顯著(P＜0.005)。模型的失擬性檢驗不顯著(P＞0.05)，說明二次模型相關(guān)性良好。比較模型的預測值和觀察值(圖4)，其預測方程的決定系數(shù)為0.9724，二者具有極顯著的相關(guān)性。模型的信噪比為12.036，其值遠大于4。所有的統(tǒng)計分析特征值表明，模型具有實踐指導意義。

圖4 預測值和觀察值之間的相關(guān)性Fig.4 Correlation between predicted and experimental results of GABA content

2.5 鹽脅迫條件下發(fā)芽大豆富集GABA的響應(yīng)面分析及優(yōu)化

為了確定發(fā)芽大豆富集GABA過程中各變量的最優(yōu)水平和相互關(guān)系，利用回歸方程可以構(gòu)建試驗因素之間的三維響應(yīng)面圖，利用響應(yīng)面曲線，可以很容易的分析因素之間的變化關(guān)系。

圖5 各兩因素交互作用對發(fā)芽大豆GABA含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction among factors on GABA accumulation in germinated soybean

圖5a表示，在培養(yǎng)溫度30℃條件下，氯化鈉濃度和培養(yǎng)時間對GABA含量的影響。氯化鈉濃度的一次項(P＜0.005)和二次項(P＜0.005)極顯著影響GABA的含量，培養(yǎng)時間的一次項(P＜0.05)和二次項(P＜0.05)顯著的影響大豆芽菜中GABA的含量，但氯化鈉濃度和培養(yǎng)時間的交互作用不顯著(P＝0.1623)。在一定的氯化鈉濃度條件下，GABA含量隨著培養(yǎng)時間的延長增加，發(fā)芽5.5d時達到最高值。同樣，在一定培養(yǎng)時間條件下，GABA含量隨著氯化鈉濃度的增加呈現(xiàn)快速的增加，在發(fā)芽5.5d后GABA的富集達到最大值，隨后GABA含量緩慢下降。豆芽中GABA的富集受到氯化鈉脅迫的影響，這與其他研究得出的鹽脅迫使植物細胞胞內(nèi)Ca2+濃度快速上升，從而誘導GAD活性上升[15]，同時，鹽脅迫還伴隨著多胺的減少和DAO活性的增加[7]，從而促進了植物中GABA的富集結(jié)果是一致的。

圖5b表示大豆芽菜培養(yǎng)5d后，氯化鈉濃度和培養(yǎng)溫度對發(fā)芽大豆富集GABA的影響。培養(yǎng)溫度的一次項(P＜0.05)和二次項(P＜0.005)顯著影響GABA的產(chǎn)量，但氯化鈉濃度和培養(yǎng)溫度的交互作用不顯著(P＞0.05)。在固定氯化鈉濃度的情況下，當培養(yǎng)溫度從25℃增加到33.3℃時，豆芽中GABA含量快速增加，繼續(xù)升高溫度時，GABA含量下降，說明33.3℃的的脅迫溫度有利于豆芽中GABA的富集。已有的研究表明，保持植物組織中GAD活性的最佳溫度為40℃[16]，較高的溫度有利于大豆芽菜中DAD酶活性的提高，導致GABA的富集，這與我們的研究結(jié)論是一致的。但大豆是適合生長在北方的耐寒性較強的作物，當溫度達到40℃時(數(shù)據(jù)未顯示)，豆芽的生長受到抑制，芽體變軟，最后會使豆芽萎縮直至死亡。

圖5c顯示了培養(yǎng)時間和溫度對發(fā)芽大豆GABA含量的影響。模型分析表明，二者的交互作用不顯著(P＞0.05)。在固定的培養(yǎng)溫度條件下，隨著培養(yǎng)時間的增加，GABA的含量上升，優(yōu)化的培養(yǎng)時間為5.5d，這與固定氯化鈉濃度條件下培養(yǎng)時間的變化趨勢一致。在固定的培養(yǎng)時間條件下，隨著溫度的增加，GABA的含量上升，優(yōu)化的培養(yǎng)溫度為33.3℃，和固定氯化鈉濃度條件下GABA隨培養(yǎng)溫度的變化相一致。

2.6 工藝條件優(yōu)化及驗證實驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，運用試驗模型得到發(fā)芽大豆富集GABA的最佳培養(yǎng)條件為氯化鈉濃度133.5mmol/L、培養(yǎng)時間5.5d、培養(yǎng)溫度33.3℃，在此條件下，GABA含量達到1197.36μg/g。

為考察模型的可靠性和準確性，隨機選擇最佳試驗組合和任一試驗組合進行驗證性實驗，驗證實驗的設(shè)計與結(jié)果列于表4。在優(yōu)化的試驗條件下，發(fā)芽大豆中GABA的含量最高，達到1197.36μg/g，這與預測值的1205.24μg/g接近，任意組合試驗也顯示了同樣的預測性，驗證實驗結(jié)果進一步證明響應(yīng)面模型優(yōu)化試驗結(jié)果是可靠的。

表4 驗證實驗結(jié)果Table 4 Results of validation tests

3 結(jié) 論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化鹽脅迫處理富集大豆芽菜GABA的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：氯化鈉濃度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度對大豆芽菜GABA富集的影響極顯著，交互項均不顯著。鹽脅迫條件下大豆發(fā)芽富集GABA的最優(yōu)條件為氯化鈉濃度133.5mmol/L、培養(yǎng)時間5.5d、培養(yǎng)溫度33.3℃，在此條件預測的最高GABA富集量為1025.24μg/g，而實際實驗測得的GABA富集量為1197.36μg/g，其相關(guān)系數(shù)極顯著(P＜0.01)。研究結(jié)果表明，大豆是生產(chǎn)富含GABA食品的優(yōu)質(zhì)原料，鹽脅迫可顯著提高豆芽中GABA的富集量。

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Optimization of GABA Accumulation Process of Germinated Soybean under Salt Stress

GUO Yuan-xin1,2，YANG Run-qiang，CHEN Hui1，SONG Yu1，GU Zhen-xin1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Based on the single factor tests, the effects of NaCl content, culture time and culture temperature onγ-aminobutyric acid (GABA) accumulation during the germination of soybean (Glycine maxL.) were explored by response surface methodology(RSM). The objective of this study was to optimize the culture conditions for GABA production in germinated soybeans under salt stress. The results showed that the optimal conditions with salt stress for GABA accumulation in germinated soybean were NaCl content of 133.5 mmol/L, culture time of 5.5 days and culture temperature of 33.3 ℃. Under the optimal conditions, the predicted highest GABA yield was up to 1205.24 μg/g. Analysis of variance and validation experiments for the regression model suggested that the model could accurately predict GABA accumulation in germinated soybean under salt stress.

soybean；germination；salt stress；γ-aminobutyric acid accumulation；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2012)10-0001-05

2011-05-10

國家自然科學基金面上項目(31071581)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項 (KYZ200917)

郭元新(1970—)，男，副教授，博士，研究方向為生物技術(shù)與食品資源高效利用。E-mail：guoyuanxiner@163.com

*通信作者：顧振新(1956—)，男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：guzx@njau.edu.cn