王吉中，楊琛琛，喬靜麗，許春平

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002）

生物法制備天然槐花煙用香料的研究

王吉中，楊琛琛，喬靜麗，許春平*

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450002）

以天然槐花為原材料，分別采用常規(guī)水提法、酶解法、美拉德反應(yīng)法并配合產(chǎn)香微生物發(fā)酵法對(duì)新型特色天然煙用香料的開發(fā)做了初步研究。采用同時(shí)蒸餾萃取裝置對(duì)各反應(yīng)體系中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行萃取，并通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）分析萃取物成分。結(jié)果表明，經(jīng)常規(guī)水提法、水提發(fā)酵法、酶解法、酶解發(fā)酵法、美拉德反應(yīng)法處理后檢測(cè)出揮發(fā)性成分分別有17、21、17、24、31種；主要香氣成分有三甲基硅脂棕櫚酸、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸、油酰胺、硬脂酸等；用酶解發(fā)酵法和美拉德反應(yīng)法所得揮發(fā)性香味物質(zhì)比用水直接提取法和單獨(dú)酶解法所得物質(zhì)種類多；經(jīng)過微生物發(fā)酵的原料比未經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質(zhì)多。

槐花，酶解，美拉德反應(yīng)，煙用香料

刺槐，又稱洋槐，落葉喬木，刺槐花味鮮潔、甜而不膩、具有槐花特有的清香。刺槐花含有多種維生素、礦物質(zhì)、刀豆酸、黃酮類等，其具有很高的食用價(jià)值，同時(shí)還具有清熱解毒、涼血潤(rùn)肺、降血壓、預(yù)防中風(fēng)的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，槐花中所含的蕓香甙，對(duì)高血壓患者有防止腦血管破裂的功效[2]。目前市面上售有很多槐花提取物，如槐花浸膏、槐花油等，作為煙用香料，能降低刺激，賦予卷煙清甜香。但是，就利用生物法制備天然槐花煙用香料的研究還未見報(bào)道[3]。因此，我們利用自然資源較為豐富的槐花，通過生物的方法來制備天然煙用生物香料，可為解決我國(guó)有限香料資源的問題提供一條好的途徑，給中式卷煙提供新型的天然香原料，并降低制香成本。本文采用多種生物法制備刺槐花香料，對(duì)所得刺槐花浸膏二氯甲烷可溶物成分進(jìn)行了GC/MS分析，為更好地開發(fā)利用我國(guó)槐花資源提供科學(xué)的依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

槐花 購(gòu)于張仲景大藥房，鄭州；產(chǎn)香酵母SP-3 鄭州輕工業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；二氯甲烷、1，2-丙二醇等化學(xué)試劑 均為分析純。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；同時(shí)蒸餾萃取裝置 鄭州玻璃儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及種子液的配制 配制常規(guī)試管斜面培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，取產(chǎn)香酵母菌種分別接種在試管斜面中，并設(shè)置對(duì)照，于真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。之后，將活化的菌種接種到液體培養(yǎng)基，于搖床中培養(yǎng)，制成種子液備用[5]。

1.2.2 常規(guī)水提法 稱取100g槐花粉末，置于1000m L的平底燒瓶（含玻璃珠）中，并加入800m L的蒸餾水，采用索氏提取裝置提取3h，取浸提液于60℃真空濃縮[6]。

1.2.3 酶解法 取100g槐花粉末，依次加入1500m L溶有0.06g纖維素酶的0.2mol/L pH為4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、溶有0.06g果膠酶的pH為8.6的巴比妥-巴比妥鈉緩沖液、溶有0.06g胰蛋白酶的0.2mol/L pH為7.6的磷酸鹽緩沖液，分別于60℃水浴中酶解3h，以4000r/m in的速度離心5m in，合并三次所得上清液，濃縮[6]。

1.2.4 美拉德反應(yīng)法 稱取木糖5g，甘氨酸3g，催化劑FeCl30.2g，丙二醇200g，蒸餾水200g置于2000m L的燒杯中。取100g槐花粉末，加入燒杯中，于100℃水浴中反應(yīng)3h[7]。過濾除去槐花碎末，于60℃真空濃縮。

1.2.5 微生物發(fā)酵法 將水提法和酶解法得到的濃縮液滅菌接種，接種量為1%，并做空白對(duì)照，置于28℃150r/m in搖床中發(fā)酵培養(yǎng)7d[7]。在發(fā)酵液和對(duì)照液中分別加入5倍體積的95%的乙醇萃取，攪拌充分，室溫靜置過夜。過濾濃縮，最終得到水提對(duì)照、水提發(fā)酵、酶解對(duì)照、酶解發(fā)酵及美拉德五種香料樣品。

1.2.6 GC-MS條件 將五種香料樣品同時(shí)進(jìn)行蒸餾萃取，并通過氣質(zhì)聯(lián)用儀分析樣品中的香味成分及其含量。

色譜條件 色譜柱：HP-5MS（60mm×132mm× 125μm）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣溫度：240℃；載氣：He；流速：1m L/m in；GC/MS接口溫度：280℃。

質(zhì)譜條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度200℃；母離子m/z 285；激活電壓1.5V；質(zhì)量掃描范圍35～455m/z。

譜圖檢索：將得到的分析譜圖與NIST譜庫(kù)串聯(lián)并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)人工檢索確定其化學(xué)組成，并通過內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯峰面積與香料中各組成成分峰面積的比值，確定各組成成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品特征描述

通過水提、水提發(fā)酵、酶解、酶解發(fā)酵、美拉德反應(yīng)五種處理方法制備的香料樣品的外觀和香味特征見表1。

實(shí)驗(yàn)表明，這五種香料樣品都具有槐花的特征香味，經(jīng)過發(fā)酵處理的香料樣品顏色加深，香氣特征更加馥郁優(yōu)美，經(jīng)美拉德反應(yīng)制得的香料具有特征的焦糖香。其香氣特征的不同特點(diǎn)是由于不同的制備方法導(dǎo)致香氣成分的不同。

2.2 香氣成分分析結(jié)果

水提對(duì)照、水提發(fā)酵、酶解對(duì)照、酶解發(fā)酵、美拉德五種樣品經(jīng)GC/MS分析，揮發(fā)性成分見表2。由表2可以看出，常規(guī)提取法共檢測(cè)出揮發(fā)性成分17種，其中酸類物質(zhì)5種，酯類物質(zhì)6種，其主要香氣成分為三甲基硅脂棕櫚酸（42.87μg/g）、鄰苯二甲酸二丁酯（29.32μg/g）、棕櫚酸（20.22μg/g）、油酰胺（14.97μg/g）、硬脂酸（5.40μg/g）；水提發(fā)酵共檢測(cè)出揮發(fā)性成分21種，其中酸類物質(zhì)7種，酯類物質(zhì)5種，其主要香氣成分為棕櫚酸（29.35μg/g）、2-苯乙基酯環(huán)丙烷羧酸（47.60μg/g）、a-亞麻酸（0.67μg/g）、三甲基硅脂棕櫚酸（23.16μg/g）、鄰苯二甲酸二異辛酯（4.95μg/g）、油酰胺（8.11μg/g）、硬脂酸（89.10μg/g）；酶解對(duì)照共檢測(cè)出揮發(fā)性成分17種，其中酸類物質(zhì)6種，酯類物質(zhì)5種，醛類物質(zhì)1種，其主要香氣成分為鄰苯二甲酸二丁酯（18.26μg/g）、5，5-二乙基丙二酰脲（71.05μg/g）、三甲基硅脂棕櫚酸（3.86μg/g）；酶解發(fā)酵共檢測(cè)出揮發(fā)性成分24種，其中醇類物質(zhì)2種，酸類物質(zhì)4種，酯類物質(zhì)5種，醛類物質(zhì)2種，其主要香氣成分為5，5-二乙基丙二酰脲（89.52μg/g）、鄰苯二甲酸二丁酯（25.54μg/g）、鄰苯二甲酸二辛酯（19.22μg/g）、3-甲基-2-苯氧基丁酰氯（16.96μg/g）；美拉德共檢測(cè)出揮發(fā)性成分31種，其中醇類物質(zhì)1種，醛類物質(zhì)1種，酸類物質(zhì)9種，酯類物質(zhì)7種，醚類物質(zhì)3種，其主要香氣物質(zhì)為1-二十烯（8.94μg/g）、四乙二醇二甲醚（45.88μg/g）、2，5，8，11，14，17，20-六乙二醇二甲醚（34.31μg/g）、碳酸丙烯酯（22.25μg/g）。用酶解法和美拉德反應(yīng)法制備槐花香料所得揮發(fā)性香味物質(zhì)比用水直接提取所得物質(zhì)種類多；經(jīng)過微生物發(fā)酵的原料比未經(jīng)過微生物發(fā)酵的原料所產(chǎn)生的香氣物質(zhì)多，這是由于發(fā)酵過程中原料中的成分進(jìn)行了轉(zhuǎn)化和分解。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的香料種類是幾種方法中最多的，比其他方法增加了如醚類、醛類、吡咯等增香物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用的是木糖與甘氨酸進(jìn)行的美拉德反應(yīng)，使得煙草香料具明顯的焦糖香[9]。

表1 不同處理方法制備香料香味的外觀狀態(tài)和特征Table 1 Appearance and characteristics of tobacco flavors prepared by differentapproach

表2 五種香料樣品的香氣成分分析結(jié)果表Table 2 Analysis of aroma compounds of five different tobacco flavors

續(xù)表

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，經(jīng)過發(fā)酵的樣品中的香味物質(zhì)與未經(jīng)發(fā)酵的樣品相比，香味物質(zhì)種類增多，這說明由產(chǎn)香微生物發(fā)酵產(chǎn)生的香料不僅風(fēng)格獨(dú)特，而且種類繁多；美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的香味物質(zhì)在種類與含量上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于水提法、酶解法，再加上本實(shí)驗(yàn)采用的是木糖與甘氨酸進(jìn)行的美拉德反應(yīng)，使得煙草香料具有顯著的焦糖香，添加到卷煙中更能豐富煙香。鑒于微生物發(fā)酵產(chǎn)香香料具有風(fēng)格可定向調(diào)控、原料易得、成本低等優(yōu)點(diǎn)，將微生物發(fā)酵工程應(yīng)用于煙用香料的開發(fā)將是一條嶄新的途徑，有待于我們進(jìn)一步去探索和開發(fā)。

[1]楊冬新.槐花與其偽品素芳花的比較鑒別[J].湖南中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，1988，4（11）：33.

[2]劉光泉.槐花藥用小方[J].農(nóng)村百事通，2009（18）：72-73.

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[4]黃致喜，徐曉瑾.煙用香料研究進(jìn)展簡(jiǎn)介[J].香料香精化妝品，2003，4（2）：25.

[5]呂品，李丹，黃龍.煙葉產(chǎn)香菌的分離及其在煙用香料制備中的應(yīng)用[J].煙草科技，2009（1）：7.

[6]楊黎華，徐若飛，李祖紅，等.天然菌類煙用香原料開發(fā)及應(yīng)用研究.中國(guó)煙草學(xué)會(huì)工業(yè)專業(yè)委員會(huì)2005煙草化學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)，2005：395-400.

[7]甄達(dá)文，于鐵妹，朱珊珊，等.利用酶法與微生物發(fā)酵法制備天然煙用香料[J].食品工業(yè)科技，2009（12）：269.

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[9]周正紅，楊華連，沈光林.美拉德反應(yīng)產(chǎn)物及其在煙草中的增香研究[J].煙草科技/卷煙工藝，1998（4）：10.

Study on preparation of tobacco flavors from Sophora japonica L. by biologicalmethods

WANG Ji-zhong，YANG Chen-chen，QIAO Jing-li，XU Chun-ping*
（College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China）

Three special natural perfumes as cigarette flavor were p roduced by water d istillation，enzymatic method，enzymatic and fermentation method，Maillard reac tion and m icrobial fermentation from Sophora japonica L.The perfumes were extracted by using simultaneous d istillation extraction method.Finally，volatile components were analyzed by GC-MS.Volatile components in the perfumes were analyzed and 17，21，17，24 and 31 d ifferent kinds of com pounds were identified in the cigarette flavors by water d istillation，fermentation after distillation，fermentation after enzymatic method and Maillard reaction，respectively.Aroma com ponents inc luded trimethylsilyl ester palm itic acid，d ibutyl phthalate，palm itic acid，oleam ide，stearic acid，etc.Final results showed that number of compounds p repared by fermentation after enzymatic method and Maillard reaction was more than that p repared by water d istillation and only enzymatic method.The number of com pounds p repared by fermentation was more than thatw ithoutm icrobial fermentation.

Sophora japonica L.；enzymatic method；Maillard reaction；tobacco flavor

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0226-04

2012－05－30 *通訊聯(lián)系人

王吉中（1974-），男，碩士，講師，主要從事生物技術(shù)方面的研究。

鄭州市科技局科技攻關(guān)項(xiàng)目（112PPTGY249-10）。