賴晨戎，夏克勝，崔 春，趙謀明

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510641）

馬氏珍珠貝蛋白降解與抗氧化性關(guān)系的研究

賴晨戎，夏克勝，崔 春，趙謀明*

（華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州 510641）

以馬氏珍珠貝肉為原料固體發(fā)酵制備米曲霉，采用還原力、DPPH自由基清除力、氧自由基清除能力（ORAC）三種指標(biāo)評價酶解過程中抗氧化性的變化。利用總氮、氨氮、肽含量以及色澤表征蛋白質(zhì)降解規(guī)律，并進(jìn)一步探究其蛋白降解規(guī)律與抗氧化活性之間的內(nèi)在聯(lián)系。結(jié)果表明，酶解液的抗氧化性隨酶解時間的延長大體呈現(xiàn)增加的趨勢，酶解36h后，還原力增加到初始的2.20倍；DPPH自由基清除力增加至初始的1.55倍；ORAC最大達(dá)到2834.67μmol Trolox/g，是等質(zhì)量的谷胱甘肽的1.13倍?？偟黾拥匠跏嫉?.89倍，氨氮增加到初始的2.57倍。在顏色變化方面，色深物質(zhì)和色率均隨著酶解時間的延長而增加。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)氨氮的變化與抗氧化性之間有顯著的相關(guān)性。

馬氏珍珠貝肉，酶解，蛋白質(zhì)降解，抗氧化性

馬氏珍珠貝（Pinctada martensii），又稱合浦珠母貝，是培養(yǎng)海水珍珠的重要貝類，廣泛分布于我國廣東、廣西和海南的沿海[1]。目前，珍珠貝肉的利用率低，具有的價值未得到充分利用。利用酶技術(shù)對其進(jìn)行加工處理是開發(fā)其潛在價值的重要手段之一。如章超樺等[2]研究發(fā)現(xiàn)馬氏珍珠貝肉酶解蛋白具有抗疲勞功能。陳美花等[3]研究發(fā)現(xiàn)運用美拉德反應(yīng)可以改良馬氏珍珠貝酶法抽提物的風(fēng)味。Katano S等[4]采用堿性蛋白酶水解馬氏珍珠貝肉，研究發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物具有抗高血壓活性。但是，酶制劑的用量大、酶解的成本高、水解度低、酶解產(chǎn)物的功能性較弱等技術(shù)難題制約了蛋白質(zhì)酶解技術(shù)在馬氏珍珠貝肉的深加工中的應(yīng)用[5]。以馬氏珍珠貝肉為原料通過制曲-酶解可獲得水解度高、生理活性高的酶解液。同時，近年來在抗氧化性機理方面的研究主要集中在顏色的變化、抗氧化肽這兩個方面。如孫玲等[6]研究發(fā)現(xiàn)若稻米的種皮顏色越深，則其生物抗氧化物質(zhì)含量越高，生物抗氧化能力越強。王惠英等[7]研究了L-賴氨酸與D-核糖的模式美拉德反應(yīng)及其褐變產(chǎn)物抗氧化性。如韓國的Se-Kwon K等[8]利用廢棄魚皮制得抗氧化肽。程云輝[9]和王雙玉等[10]分別從麥胚蛋白、玉米醇溶蛋白中也得到了抗氧化活性肽。關(guān)于以馬氏珍珠貝肉為原料通過制曲-酶解得到的產(chǎn)物的抗氧化性以及相關(guān)機理方面還沒有系統(tǒng)的研究報道。實驗以馬氏珍珠貝肉為原料通過米曲霉固體制曲-酶解制備酶解液，對酶解過程的總氮、氨氮、顏色、抗氧化性的變化等進(jìn)行了比較深入的研究，并探討其蛋白降解規(guī)律與抗氧化活性之間的關(guān)系，為珍珠貝肉的高效利用提供理論和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

馬氏珍珠貝肉 面粉市售；曲精（滬釀3.042孢子粉） 孢子發(fā)芽率≥80%，孢子數(shù)≥300億/g干基，水分≤10%；Trolox、標(biāo)準(zhǔn)肽樣品Cytochrome C（分子量為12500）、Aprotinin（分子量為6500）、Vitam in B12（分子量為1355）、Oxidized glutathione（分子量為612）、Glycylglycylglycine（分子量為189） 由Sigma公司提供；其他試劑均為 分析純。

MJ-176NR攪拌機 日本Panasonic公司；ZJPA1230霉菌培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；THZ-82A恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；UV-2100分光光度計 Unico（上海）儀器有林大機械有限公司；KDN-2C定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；DFT-200手提式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；M inolta CR-400色差計 日本大阪Konica Minolta Sensing公司；GL-21M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀 芬蘭Thermo Scientific公司；快速蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國Amersham Biosciences公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬氏珍珠貝肉的發(fā)酵和酶解工藝[5]取新鮮的馬氏珍珠貝肉約4000g，在121℃加熱10m in后得到熟貝肉。取熟貝肉添加25%（w∶w）面粉，接入0.5‰（以混料后總物質(zhì)重量計，w∶w）米曲精制曲，25～35℃培養(yǎng)44h后得到成曲。取成曲100g，以料液比1∶2.5（w∶w）加去離子水搖勻，恒溫53℃攪拌水解，分別于1、2、4、8、12、24、36h取樣，并在沸水浴中滅酶20min，離心（4℃、6000r/m in、15m in），取上清液，為所得酶解產(chǎn)物。其中未水解樣（0h）是成曲常溫混水后搖勻，離心得到的液體，即成曲的水溶性提取物。

1.2.2 抗氧化性測定方法

1.2.2.1 清除DPPH自由基的測定方法[11]酶解0、1、2h分別稀釋50、100倍；4、8h分別稀釋50、100、200倍；12、24、36h分別稀釋100、150、200倍。分別測DPPH自由基清除能力，求出不同酶解時間段的IC50值。

1.2.2.2 還原力的測定方法[11]酶解1、2、4、8、12、24、36h的樣品分別稀釋10倍，分別測定還原力。

1.2.2.3 氧自由基清除能力（ORAC）的測定方法[12]酶解0h稀釋500倍；1、2h稀釋1000倍；4、8h稀釋2000倍；12、24、36h稀釋3000倍，分別測定ORAC值。

1.2.3 含氮量測定方法

1.2.3.1 總氮的測定 凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2010。

1.2.3.2 氨基酸態(tài)氮的測定 甲醛滴定法，參照GB/T 5009.39-2003。

1.2.4 分子量測定 凝膠色譜法，色譜條件：Amersham蛋白質(zhì)分析純化系統(tǒng)，Superdex_peptide_10/300_GL分離柱，洗脫液為0.25mol/L NaCl，pH 7.2磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為0.5m L/m in，檢測波長為214nm。標(biāo)準(zhǔn)肽樣品與洗脫液體積擬合直線方程為lgM=-0.1499V+ 5.6297（R2=0.9957），式中：lgM為標(biāo)準(zhǔn)肽分子量的對數(shù)；V為洗脫液體積。

1.2.5 顏色測定

1.2.5.1 色率的測定[13]參考孫宇霞的方法，使用最小二乘方回歸法得到標(biāo)準(zhǔn)方程：

式中：y為色率；x為吸光度A值。

測定時將樣品稀釋10倍，用分光光度計，在520nm波長下，以蒸餾水做空白，測出吸光度A值，將A值乘以稀釋倍數(shù)10后，代入上述方程得色率。

1.2.5.2 色深物質(zhì)定量測定[14]參考李瑩等的方法，將樣品稀釋10倍，測定其在420nm處的吸光值A(chǔ)420nm。色深物質(zhì)定量對比時計算公式：

式中：C為色深物質(zhì)定量值；10為稀釋倍數(shù)。

1.2.5.3 紅色指數(shù)和黃色指數(shù)的測定 參考鄭海燕[15]和秦祖贈[16]的方法，將樣品稀釋10倍，分別在波長460、510、610nm下測得光密度值D1、D2和D3。其中，紅色指數(shù)由10×lg（D2/D3）表示；黃色指數(shù)由10×lg（D1/D3）表示。

1.2.6 實驗重復(fù)三次，采用SPSS 13.0和Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同時間段的酶解液中總氮和氨氮的分析

圖1 酶解產(chǎn)物中總氮和氨氮的變化Fig.1 The change of total nitrogen and ammonia nitrogen in hydrolysate

由圖1可知，隨著酶解時間的延長，酶解產(chǎn)物的總氮和氨氮含量均呈上升趨勢，總氮由0h的0.0067g/m L增加至36h的0.0127g/m L，增加了0.89倍。氨氮的含量也由0h的0.0024g/m L逐漸增加至36h的0.0062g/m L，增加了1.57倍。其中，酶解8h前，總氮和氨氮的含量均增加較快。分別增加了0.75、1.02倍。這是由于大分子蛋白質(zhì)在酶的作用下，被剪切為多肽和氨基酸而溶于水。酶解8h后，總氮含量基本保持穩(wěn)定，因為大部分不溶性蛋白質(zhì)已轉(zhuǎn)化為可溶性多肽和氨基酸，剩下的含氮物質(zhì)較難溶于水中。而氨氮含量仍保持較快的速度增加，主要由于酶以可溶性多肽為底物將其進(jìn)一步降解為氨基酸和小分子肽[17]。

表1 不同酶解液的分子量分布百分比（%）Table 1 Molecularweight distribution percentage of hydrolysate（%）

2.2 不同時間段的酶解液中分子量分布

圖2 酶解液的分子量分布圖Fig.2 Molecular weight distribution of hydrolysate

由圖2和表1可知，酶解液在凝膠柱上的保留體積大部分大于17.54m L（分子量為3000u），這表明酶解液中的肽類分子量以3000u以下的為主。不同時間段的酶解液肽分子量的大體變化趨勢是：隨著酶解時間的延長，大分子質(zhì)量的肽含量逐漸減少，小分子質(zhì)量的肽含量、氨基酸等物質(zhì)逐漸增加，肽峰呈現(xiàn)向后推移的趨勢。未酶解的樣品（0h）中蛋白質(zhì)分子量主要集中在＜1000u的分子量段上，其占總量的60.40%；酶解1h后，分子質(zhì)量＞10000u的肽含量比值顯著減少，由18.10%降至3.14%，而分子質(zhì)量在3000～ 1000u的肽含量比值顯著增加，由14.90%增加到24.02%，可見酶解1h內(nèi)，分子量＞10000u的肽大部分被酶剪切成1000～3000u的肽段；隨著酶解時間的延長，分子量＞10000u的肽一直被降解，酶解時間達(dá)8h后，分子量＞10000u肽含量基本保持在2.00%的水平；分子量＜1000u的肽段在酶解過程中一直保持增加的趨勢，酶解時間在0～8h時，此區(qū)間肽段含量增加速率較快，由0h的60.40%增加至8h的72.24%，而酶解時間達(dá)到8h后，其含量增加趨勢變緩。

2.3 不同酶解時間對酶解液顏色的影響

色率是用來評價酶解液顏色深淺的指標(biāo)。酶解前2h，色率逐漸下降，隨后，色率隨酶解時間的延長而不斷增加。酶解36h時，色率達(dá)到5.61。在整個酶解過程中，色深物質(zhì)含量變化隨著酶解時間的延長也呈現(xiàn)增加的趨勢，且色深物質(zhì)和色率具有極顯著的相關(guān)性（R2=0.992）。紅色指數(shù)是反映酶解液中紅色的強弱。紅色指數(shù)越大，紅色色調(diào)越深。黃色指數(shù)是反映酶解液中黃色的強弱，黃色指數(shù)越大，黃色色調(diào)越明顯。在酶解過程中，紅色指數(shù)和黃色指數(shù)都基本保持穩(wěn)定。色率的增加可能主要是由于色深物質(zhì)的增加。色深物質(zhì)不斷增加的原因可能是酶解過程中酶解液的還原糖與氨基酸、肽及蛋白質(zhì)進(jìn)行美拉德反應(yīng)[13]或者是酶解液中肌血球素和黑色素發(fā)生了氧化作用[18]。在酶解前期色率的下降可能主要因為初期酶解液中色深物質(zhì)的不斷積累和消耗，色澤前體物質(zhì)的不斷溶出和消耗的動態(tài)變化引起了樣品在可見光下的吸光度有所變化。

表2 不同酶解時間對酶解液顏色的影響Table 2 Effectof differenthydrolysis time on hydrolysate’s color

2.4 不同酶解時間對酶解液的抗氧化性的影響

2.4.1 不同酶解時間對酶解液還原力的影響 在一般情況下，物質(zhì)的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)。研究表明，抗氧化物質(zhì)通過提供電子可阻斷Fe2+向Fe3+的轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)出一定的還原能力。在波長700nm處測定的吸光度越大，則樣品的還原能力越強。如圖3所示，0h樣液的還原力是1.01，隨著酶解時間延長逐漸增加。其中，在1～2h過程中，還原力增加較快，增加了51%，到達(dá)酶解24h時還原力達(dá)到最高點，為2.22，增加了1.2倍。酶解24h后，還原力基本保持穩(wěn)定。這可能是因為酶解24h后酶的剪切作用使得具有抗氧化性的基團(tuán)已經(jīng)充分暴露。

圖3 不同酶解時間對酶解液還原力的影響Fig.3 Effectof differenthydrolysis time on hydrolysate’s reducing power

2.4.2 不同酶解時間對酶解液清除DPPH自由基能力的影響 二苯代苦味酰肼自由基（DPPH自由基）是一種比較穩(wěn)定的脂溶性自由基，其N上有一個游離電子。若某物質(zhì)能夠清除它，則表示這個物質(zhì)具有降低羥基自由基、烷基自由基或者過氧自由基的有效濃度或具有打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用[19]。因此，DPPH自由基清除模型是一種廣泛用于評價抗氧化劑自由基清除能力的快速方法。圖4中可看出隨著酶解時間的延長，IC50值從0h的0.802mg/m L降到36h的0.518mg/m L，下降了35.41%。在酶解2～4h內(nèi)，IC50值變化明顯，下降了25%。酶解4h后，IC50值下降變緩。本研究中的酶解液的DPPH自由基清除力明顯高于已有報道[20]中馬氏珍珠貝肉雙酶水解產(chǎn)物的DPPH自由基清除力（即使?jié)舛雀哌_(dá)5mg/m L時，對DPPH自由基的清除力仍低于50%），也顯著高于另一報道[21]中四種商業(yè)酶（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、Alcalase 2.4L）的馬氏珍珠貝肉殘渣酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除力（對DPPH自由基的清除力始終低于40%）。

圖4 不同酶解時間對酶解液清除DPPH自由基能力的影響Fig.4 Effect of differenthydrolysis time on hydrolysate’s DPPH radical scavenging activity

2.4.3 不同酶解時間對酶解液氧自由基清除能力（ORAC）的影響 氧自由基清除能力（ORAC）的測定是以偶氮類化合物AAPH作為過氧自由基來源，以Sodium Fluorescein（FL）作為熒光指示劑，以抗氧化劑Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)，用來定量樣品的抗氧化能力。由圖5中可以看出，隨著酶解時間的延長，不同時間段的酶解液的Trolox當(dāng)量大體變化趨勢是逐漸增強的。從酶解0h的1094.65μmol Trolox/g逐漸增加至36h的2834.67μmol Trolox/g，此時達(dá)到最高值，是0h的2.59倍。36h酶解液的Trolox當(dāng)量是等質(zhì)量的谷胱甘肽的1.13倍，遠(yuǎn)高于已有報道[22]中的花生蛋白酶解物的Trolox當(dāng)量（ORAC值是1943.6μmol Trolox equivalent/g peptid）和另一報道[23]中的商業(yè)酶（A lcalase）酶解大豆分離蛋白的酶解產(chǎn)物Trolox當(dāng)量（ORAC值是1900.48μmol Trolox equivalent/g peptid）。結(jié)合還原力和DPPH自由基清除力可知，盡管對抗氧化性的評價方法不同，但體現(xiàn)出酶解過程中酶解液的抗氧化能力變化趨勢大體一致。

圖5 不同酶解時間對酶解液氧自由基清除能力（ORAC）的影響Fig.5 Effectof differenthydrolysis time on hydrolysate’s oxygen radical absorbance capacity（ORAC）

2.5 顏色、氨氮和抗氧化性指標(biāo)間的相關(guān)性分析

表3 顏色、氨氮和抗氧化性的相關(guān)性分析Table 3 The correlation analysis between color，ammonia nitrogen and antioxidantactivity

由表3可知，酶解液中顏色的變化和抗氧化性之間無顯著的相關(guān)性，而氨氮含量的變化與抗氧化性各項指標(biāo)之間有顯著的相關(guān)性。

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果顯示，在酶解過程中，抗氧化性大體呈現(xiàn)增加的趨勢。還原力、DPPH自由基清除力和ORAC值均有不同程度的增加。酶解液具有較強的還原力、清除DPPH自由基和抑制過氧自由基的能力。其中，36h酶解液的ORAC值是等質(zhì)量的谷胱甘肽的1.13倍。酶解時間達(dá)到24～36h時，抗氧化能力達(dá)到最高值，因此深度酶解有利于酶解液中抗氧化性的提高。隨著酶解時間的增加，色深物質(zhì)大致呈現(xiàn)增加的趨勢。總氮、氨氮含量也在酶解過程中呈現(xiàn)增加的趨勢。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，氨氮含量的變化與抗氧化性之間具有顯著的相關(guān)性，顏色的變化和抗氧化性之間的相關(guān)性不顯著。

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Research of the relationship between protein degradation’s laws and antioxidant activity of Pinctada martensii

LAIChen-rong，XIA Ke-sheng，CUIChun，ZHAO M ou-m ing*
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China）

Aspergillus oryzae was cultivated w ith Pinctada martensii on solid culture medium，then it was hyd rolysed.Reducing power，DPPH radical scavenging ac tivity，oxygen radical absorbance capacity（ORAC）were used to evaluate the hyd rolysate’s antioxidant activity.Total nitrogen，ammonia nitrogen，pep tide and color were used to stand for the laws of p rotein deg radation，the relationship between p rotein deg radation’s laws and hyd rolysate’s antioxidantactivity was also researched.The results showed that the antioxidantactivity of the fluid showed an increasing trend with the increasing hyd rolysis time，the reducing power was 2.20 times as much as before.DPPH radical scavenging ac tivity was 1.55 times as much as before.ORAC reached the maximum of 2834.67μmol Trolox/g（36h），which was 1.13 times as much as the equalquality of the g lutathione. The totalnitrogen was 1.89 times as much as before，the ammonia nitrogen was 2.57 times as much as before. As for the change of colour，both of dark substance and the rate of color showed an increasing trend w ith the increasing hyd rolysis time.According to the correlation analysis，the relevance between the change of ammonia nitrogen and the antioxidant activity was significant.

Pinc tada martensii；hyd rolysate；p rotein degradation；antioxidant activity

TS254.9

A

1002-0306（2012）20-0123-05

2012－05－24 *通訊聯(lián)系人

賴晨戎（1989-），女，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

廣東省中國科學(xué)院全面戰(zhàn)略合作項目（2010A090100023）；廣東省水產(chǎn)蛋白改性技術(shù)研究團(tuán)隊專項（2011A020102005）；廣東省教育部科技部企業(yè)科技特派員行動計劃專項項目（2009B090600120）。