廖秋菊 王 晶 秦 儉

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院急診科，北京 100053)

急性一氧化碳(carbon monoxide，CO)中毒患者治療后意識障礙恢復，經(jīng)過2～60 d“假愈期”，出現(xiàn)以精神意識障礙、大腦皮質(zhì)局灶性功能障礙、腦神經(jīng)損害及周圍神經(jīng)炎為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損害稱為遲發(fā)性腦病(delayed neuropsychologic sequelae，DNS)，其發(fā)病率國內(nèi)為10% ～30%，國外為0.8% ～43.0%［1-3］。本病預后差，而且尚無有效的治療措施，具有高致殘率的特點［4］。胰島素及胰島素受體普遍存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中［5］，能夠減少受損神經(jīng)細胞凋亡，具有神經(jīng)保護作用［6］。本研究通過觀察胰島素對急性CO中毒動物行為學和神經(jīng)細胞凋亡的影響，了解胰島素對DNS是否具有預防和治療作用，為臨床治療CO中毒提供新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠，SPF(specific pathogen free)級，雄性，體質(zhì)量290～330 g，由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院動物實驗室提供，動物許可證號:SYXK(京)2010-0013。

1.2 儀器設備

Morris水迷宮及分析軟件(中國醫(yī)學科學院藥物研究所);WFZ800-3型紫外可見單光束分光光度計(北京瑞利光學儀器廠);電子血糖儀(ACCU-CHEK Active，德國羅氏公司);Image-pro Plus圖像分析系統(tǒng)(Version4.0)(美國 Media Cybernetics公司)。

1.3 試劑

一氧化碳氣體(99.9%)(北京市氣體站);普通胰島素(南京新百藥業(yè)有限公司);TUNEL凋亡檢測試劑盒(德國羅氏公司);羅氏血糖儀血糖試紙(德國羅氏公司);其余試劑均為國產(chǎn)分析純，購自北京化學試劑公司。

1.4 急性CO中毒大鼠模型建立

實驗大鼠購入后，經(jīng)適應性飼養(yǎng)和編號后進行5 d水迷宮訓練。電腦記錄大鼠巡游軌跡、從入水至登上安全島的時間(逃避潛伏期)等數(shù)據(jù)。逃避潛伏期超過2 min者記為失敗。每天訓練2～3次，5 d后以巡游軌跡為直線式或趨向式，逃避時間小于1 min的大鼠為合格;逃避時間大于1 min的大鼠被淘汰。參考王耀宏等［7］、付守芝等［8］方法制備大鼠急性 CO中毒模型。將CO氣體按照150 mL/kg快速注入大鼠腹腔，每間隔4 h腹腔注射1次，從第2次開始氣體量減半，共注入氣體3次。觀察大鼠急性CO中毒后意識狀態(tài)及體征。對照組大鼠注射同等劑量空氣。

1.5 胰島素干預

第3次腹腔注射CO氣體4 h后，將存活的大鼠采用抽簽法隨機分為CO中毒模型組(模型組，15只)，CO中毒模型+胰島素組(胰島素組，15只)。胰島素組腹腔注射1.2 mL胰島素葡萄糖混合液(2 U/Kg普通胰島素、2 g/kg葡萄糖)，模型組、對照組(8只)腹腔注射等劑量的0.9%氯化鈉注射液，連續(xù)給藥7 d。

1.6 碳氧血紅蛋白濃度測定

分別于大鼠中毒后0.5、4及4.5 h測定碳氧血紅蛋白濃度。具體方法:大鼠斷尾取血，采用改良雙波長COHb定量法檢測各組大鼠血COHb濃度;取大鼠尾血0.1 mL加0.4 mol/L氫氧化銨 20 mL，混勻，加20 mg低亞硫酸鈉混勻;10 min內(nèi)于535 nm及578 nm波長下測定其吸光度，按照下列公式計算COHb含量(%):

COHb(%)=(2 144×A535/A578－2 168)×100%

1.7 血糖測定

胰島素組腹腔注射胰島素前及注射后1 h取鼠尾血用羅氏血糖儀測血糖，對照組和模型組在上述2個時間同時測血糖。

1.8 Morris水迷宮檢測

各組大鼠中毒后1～5周重復進行水迷宮檢測，每周測試1次。每次將大鼠放入安全島對側(cè)的象限，記錄其逃避潛伏期。

1.9 動物灌注及固定

各組大鼠第5周處死。大鼠腹腔注射10% 的水合氯醛(4 mL/kg)。動物麻醉成功后，將其仰臥于平臺上，伸展固定四肢，開胸腹充分暴露心臟和肝臟。剪開左側(cè)心尖部，經(jīng)左心室-升主動脈迅速插管，同時剪開右心耳，先快速灌注0.9%氯化鈉注射液200～250 mL，待肝臟完全變白、右心耳流出澄清液體后，改灌4℃預冷的4%多聚甲醛固定液250～300 mL，其中前1/3量快速灌注，后2/3量緩慢灌注，灌注時間約30 min。當肝臟變硬、四肢僵硬即固定完成。斷頭取腦，投入含30%蔗糖的多聚甲醛后固定液中，24 h置換新后固定液，4℃保存。

1.10 細胞凋亡檢測

取大鼠大腦組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟后，3%H2O2甲醇室溫孵育30 min;用樣品通透液冰浴下通透5 min，血清37℃孵育30 min，加入按1∶9稀釋好的反應液，37℃孵育30 min;加POD轉(zhuǎn)換液，每步之間用PBST洗滌。DAB工作液顯色2 min左右，鏡下控制染色程度;中性樹膠封片。

陽性細胞計數(shù)及光吸收值測量:每組動物各取位置相同的3張腦片，在10倍物鏡下，以Image-proPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)計數(shù)海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)陽性細胞數(shù)(TUNEL陽性細胞為棕色深染的細胞)，每張腦片計數(shù)10次，取平均值，病理結(jié)果評價采用雙盲分析。

1.11 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，對水迷宮測試結(jié)果進行重復測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析，對免疫組織化學染色結(jié)果進行單因素方差分析，組間比較采用多因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠CO中毒后行為表現(xiàn)

大鼠腹腔注射CO氣體后5～10 min出現(xiàn)多動、煩躁;染毒20 min后陸續(xù)出現(xiàn)少動、四肢癱軟、抽搐、昏迷，黏膜及肢端皮膚呈櫻桃紅色，部分發(fā)生角弓反張。約50%大鼠在中毒24 h內(nèi)死亡。中毒后8 h左右大鼠恢復正常。大鼠中毒后符合急性CO中毒表現(xiàn)。

2.2 Morris水迷宮檢測認知功能

對各組大鼠進行1～5周的水迷宮檢測后發(fā)現(xiàn):中毒后第1周模型組及胰島素組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，巡游軌跡以圓周式和隨機式為主;從第2周開始，胰島素組大鼠逃避潛伏期時間逐漸縮短，至3周已接近對照組，巡游軌跡以直線、趨向勢為主，且差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);從第2周開始，胰島素組逃避潛伏期比模型組明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖1)。

2.3 細胞凋亡檢測結(jié)果

圖1 不同時間大鼠水迷宮潛伏期時間結(jié)果Fig.1 Water maze in rats at different times of incubation time CO group:carbon monoxide group.

利用免疫組化方法測定CO中毒后第5周海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡情況。利用400倍顯微鏡放大觀察，發(fā)現(xiàn)對照組海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)區(qū)域有少量棕色陽性細胞;模型組及胰島素組在海馬CA1區(qū)及皮質(zhì)均見棕色陽性細胞，胰島素組陽性細胞數(shù)低于模型組，各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組及胰島素組均高于對照組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，詳見圖2。

圖2 TUNEL染色檢測的腦組織細胞凋亡Fig.2 TUNEL staining of brain cells(400×)CO group:carbon monoxide group.

2.4 各組大鼠不同時間點血COHb

模型組、胰島素組大鼠中毒后0.5 h血COHb濃度明顯升高，波動于48% ～67%之間，與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。達到中、重度中毒標準。中毒后4 h，大鼠COHb濃度下降約25%;再次染毒后0.5 h血中COHb濃度再次達到高水平，3次染毒使得大鼠血COHb濃度達到45%以上并能保持12 h。模型組與胰島素組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，詳見表1。

2.5 腹腔注射胰島素對大鼠血糖的影響

給藥前、后1 h模型組及胰島素組大鼠靜脈血糖水平均較對照組升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，胰島素組給藥前、給藥后1h靜脈血糖無明顯變化(P＞0.05)，詳見表2。

表1 不同時間點大鼠血COHb濃度結(jié)果Tab.1 Different time points in rat blood COHb concentration results(±s)%

表1 不同時間點大鼠血COHb濃度結(jié)果Tab.1 Different time points in rat blood COHb concentration results(±s)%

* P ＜0.05 vs control group;CO:carbon monoxide.

Group Number of case Time/h 0.5 4 4.5 Control group 8 1.00 ±0.17 1.00 ±0.14 1.00 ±0.171 CO group 15 59.67 ±5.16* 44.75 ±3.87* 55.67 ±3.91*RI-treated-group 15 60.04 ±5.44* 45.03 ±4.08* 52.047 ±3.98*

表2 各組大鼠給藥前后靜脈血糖的比較Tab.2 Rats compared before and after administration of intravenous glucose(±s)mmol/L

表2 各組大鼠給藥前后靜脈血糖的比較Tab.2 Rats compared before and after administration of intravenous glucose(±s)mmol/L

* P ＜0.05 vs control group;CO:carbon monoxide.

Group Number of case Before administration 1 h after administration Control group 8 5.01 ±0.50 5.02 ±0.49 CO group 15 6.42 ±0.79* 6.24 ±0.71*RI-treated-group 15 6.27 ±0.86* 6.11 ±0.88*

3 討論

本研究通過對大鼠認知功能以及神經(jīng)細胞形態(tài)學檢測發(fā)現(xiàn)，胰島素腹腔注射對DNS模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用。接受胰島素干預的大鼠認知功能下降減輕，腦神經(jīng)細胞凋亡減少，遲發(fā)性腦損傷程度顯著降低。

CO中毒早期為CO與血液中的血紅蛋白結(jié)合，形成碳氧血紅蛋白(COHb)，導致組織細胞缺氧。腦組織在嚴重缺氧早期，神經(jīng)元出現(xiàn)變性壞死;同時腦組織的血管內(nèi)皮細胞也因缺氧出現(xiàn)變性及功能障礙，導致血管通透性增強造成腦水腫;血管內(nèi)血流緩慢甚至形成微血栓使腦組織更廣泛的缺血。由于腦組織嚴重缺氧、缺血及CO本身的細胞毒性作用，增強神經(jīng)元氧化應激反應、Ca2+內(nèi)流大量增加，興奮性氨基酸釋放增加并啟動神經(jīng)元凋亡信號轉(zhuǎn)導，凋亡相關蛋白表達、合成增加，從而造成神經(jīng)元凋亡，導致CO中毒后遲發(fā)性神經(jīng)損傷。因此CO中毒機制本身與缺血缺氧致腦損傷機制極為相似。

本實驗采用王耀宏等［7］、付守芝等［8］腹腔注射 CO氣體法成功制備大鼠DNS模型。此方法與吸入CO氣體方法比較具有操作簡便，所需CO量明顯減少，費用低廉，不需特殊儀器，染毒劑量容易控制，影響因素少等特點。McDonnell T J等［9］研究表明，遲發(fā)性腦病的發(fā)病與中毒程度、昏迷時間和初次治療效果等密切相關。本實驗方法制備的中毒模型使大鼠血中COHb濃度高于48%并維持12 h之久，達到中重度中毒標準，十分類似臨床上重癥CO中毒病情經(jīng)過，因此我們認為腹腔注射CO方法制備重度CO中毒模型成功。

Morris水迷宮實驗是判斷大鼠學習和記憶能力的重要指標，能敏感的反映出腦認知功能區(qū)損害后的認知功能變化［10］。本實驗發(fā)現(xiàn)，胰島素組大鼠逃避潛伏期明顯低于模型組，說明胰島素組大鼠學習記憶能力明顯提高。胰島素已被證明在人類與實驗動物中都具有記憶增強效應。實驗顯示，在大鼠腦缺血后立即同時給予胰島素，可減輕大鼠在缺血1～2個月后的學習能力缺陷，而僅增加葡萄糖的供給則不能產(chǎn)生上述作用［11］。我們的實驗結(jié)果證明，胰島素還可以改善CO中毒大鼠的學習、記憶能力。

海馬結(jié)構(gòu)(hippocampal formation)是大腦邊緣系統(tǒng)的一個重要組成部分，其功能主要參與學習與記憶、情緒反應以及調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動等［12］。皮質(zhì)與海馬在解剖學上有密切的聯(lián)系，因此，皮質(zhì)在認知過程中也扮演了十分重要的角色［13］。海馬神經(jīng)元細胞，尤其是CAl區(qū)對缺血缺氧十分敏感［14-15］，海馬的損傷會導致學習記憶的障礙［16］。付守芝等［8］采用一次性腹腔注入CO氣體(150 mL/kg)制備模型，采用TURNEL法檢測腦組織，發(fā)現(xiàn)CO中毒后6周遲發(fā)性腦病大鼠海馬區(qū)見較多凋亡細胞表達，明顯高于非遲發(fā)性腦病大鼠，證實凋亡與遲發(fā)性腦病有關。

胰島素及其受體廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，胰島素及其受體在嗅球、大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)和海馬結(jié)構(gòu)等區(qū)域的神經(jīng)元內(nèi)表達水平較高，提示其可能參與了如學習和記憶等高級腦功能活動。胰島素在缺血缺氧模型中對神經(jīng)元的保護作用已得到證實。Sanderson T H等［17］通過雙側(cè)頸動脈夾閉10 min聯(lián)合低血壓的方法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)一次性給予高劑量胰島素(20 U/kg)，利用尼氏染色發(fā)現(xiàn)胰島素組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)改變較小，神經(jīng)元缺失減少，利用水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)胰島素組大鼠學習記憶能力更好，說明胰島素具有神經(jīng)保護作用。本實驗中，CO中毒后給予大鼠腹腔注射胰島素后第5周TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)大鼠皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡均明顯低于模型組。說明外源性胰島素能夠減少CO中毒后大鼠海馬及皮質(zhì)神經(jīng)元變性和凋亡，減輕神經(jīng)元損傷，從而提高大鼠的認知功能。

綜上所述，我們認為外源性應用胰島素可以減輕大鼠CO中毒后遲發(fā)型腦病，其作用機制可能是減輕大腦認知功能區(qū)細胞凋亡，改善其認知功能。因此，我們認為在臨床上應用胰島素治療可以減輕CO中毒后腦損傷，為臨床防治CO中毒后遲發(fā)型腦病提供新的治療方法。

［1］Turner M.Carbon monoxide poisoning［J］.B M J，2000，320(7237):804.

［2］Varon J，Marik P E，F(xiàn)romm Jr R E，et al.Carbon monoxide poisoning:a review for clinicians［J］.J Emergency Med，1999，17(1):87-93.

［3］Piantadosi C A.Carbon monoxide poisoning［J］.N Engl J Med，2002，347(14):1054-1055.

［4］李正斌，岳玉桃，宮耀宇，等.急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的預防研究［J］.中國急救醫(yī)學，2003，23(4):208-210.

［5］Zhivotovsky B，Cedervall B，Jiang S N，et al.Involvement of Ca2+in the formation of high-molecular-weight DNA fragments in thymocyte apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，1994，202(1):120-127.

［6］Nakata N，Kato H，Liu Y，et al.Effects of pretreatment with sublethal ischemia on the extracellular glutamate concentrations during secondary ischemia in the gerbil hippocampus evaluated with intracerebral microdialysis［J］.Neurosci Lett，1992，138(1):86-88.

［7］王耀宏，趙金垣，崔書杰，等.急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的動物模型制備研究［J］.中國職業(yè)醫(yī)學，2004，31(1):5-10.

［8］付守芝，劉勇，楊建業(yè)，等.腹腔注射法建立一氧化碳遲發(fā)性腦病大鼠模型［J］.中國急救醫(yī)學，2007，27(11):996-998.

［9］McDonnell T J，Beham A，Sarkiss M，et al.Importance of the Bcl-2 family in cell death regulation［J］.Experientia，1996，52(10-11):1008-1017.

［10］Jia X，Koenig M A，Shin H C，et al.Improving neurological outcomes post-cardiac arrest in a rat model:Immediate hypothermia and quantitative EEG monitoring［J］.Resuscitation，2008，76(3):431-442.

［11］劉福佳，高春錦，夏成青，等.急性一氧化碳中毒小鼠腦海馬細胞凋亡及bcl-2，Bax和caspase-3蛋白表達［J］.中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志，2005，12(2):66-68.

［12］劉穎菊，楊俊卿，周歧新，等.急性一氧化碳中毒致腦細胞凋亡及相關基因表達［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2000，26(5):257-260.

［13］崔書杰.急性一氧化碳中毒遲發(fā)腦病的治療研究進展［J］.職業(yè)衛(wèi)生與應急救援，2002，20(1):35-38.

［14］寇小格，梁東良，石金河，等.激素和鞘內(nèi)給藥治療急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病的臨床研究［J］.中國工業(yè)醫(yī)學雜志，2007，20(1):30-31.

［15］Thom S R，Bhopale V M，F(xiàn)isher D，et al.Delayed neuropathology after carbon monoxide poisoning is immune-mediated［J］.Proc Nat Acad Sci U S A，2004，101(37):13660-13665.

［16］Hirsch E，Costa C，Ciraolo E.Phosphoinositide 3-kinases as a common platform for multi-hormone signaling［J］.J Endocrinol，2007，194(2):243-256.

［17］Sanderson T H，Kumar R，Murariu-Dobrin A C，et al.Insulin activates the PI3K-Akt survival pathway in vulnerable neurons following global brain ischemia［J］.Neurol Res，2009，31(9):947-958.