劉春濤 朱圣韜 田 月 張澍田

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科北京市消化疾病中心，北京 100050)

我國是食管癌的高發(fā)國家，每年約有25萬新診斷的食管癌病例，占世界食管癌病例數(shù)的一半。與歐美國家不同，我國食管癌的組織學(xué)類型以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為主。雖然近年來食管鱗癌的診治水平有了顯著提高，但大多數(shù)病例發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于進(jìn)展期，抗癌治療的效果較差。因此，到目前為止我國仍是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家［1］。

c-Met是肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的受體，位于細(xì)胞表面，與HGF結(jié)合后可以導(dǎo)致下游多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，如Erk、Akt和Stat3等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移［2］。既往研究［3-5］發(fā)現(xiàn)，c-Met在結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌、肺癌等多種腫瘤組織中過表達(dá)，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。然而，目前關(guān)于c-Met在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其在食管鱗癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的作用少有報(bào)道。

本研究以87例食管鱗癌標(biāo)本及配對(duì)癌旁組織作為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)c-Met的表達(dá)，闡明其與食管鱗癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討c-Met作為食管鱗癌治療靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

87對(duì)甲醛固定，石蠟包埋的食管鱗狀細(xì)胞癌及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本取自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院病理科。手術(shù)時(shí)間為2008年至2011年，其中男性標(biāo)本73例，女性標(biāo)本14例，患者年齡41～81歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例占47.1%(41/87)。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)。同時(shí)收集患者的臨床資料。腫瘤分期根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟食管鱗癌臨床病理分期(tumornode-metastasis，TNM)分期標(biāo)準(zhǔn)(第 7 版)確定［6］。所有病例術(shù)前均未接受化學(xué)治療或放射治療。

1.2 試劑

兔抗人c-Met單克隆抗體購自美國CST公司。二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒購自基因科技(上海)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及陽性結(jié)果判斷

烤片、二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水，PBS緩沖液洗3次，每次5 min;3%H2O2(80%甲醇)阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性;抗原高壓熱修復(fù)10 min，抗原修復(fù)液為0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液;滴加兔抗人c-Met單克隆抗體IgG(1∶100)，室溫孵育2 h，PBS溶液漂洗3次，每次5 min;滴加100 μL A液(二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒)，室溫孵育30 min，PBS溶液漂洗3次，每次5 min;最后滴加顯色劑DAB工作液，光鏡下控制顯色，顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色;蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片;顯微鏡下觀察，以細(xì)胞膜呈棕黃色作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Pearson χ2檢驗(yàn)檢測(cè)c-Met的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-Met在食管鱗癌及癌旁組織中的表達(dá)

c-Met主要表達(dá)于細(xì)胞膜，表現(xiàn)為胞膜呈棕黃色染色。87例食管鱗癌組織中有29例(33.3%)呈陽性表達(dá)，配對(duì)癌旁組織中未見c-Met表達(dá)(圖1)。

圖1 c-Met在食管鱗癌及癌旁食管復(fù)層鱗狀上皮中的表達(dá)Fig.1 c-Met expression in esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal tissues(200×)

2.2 c-Met與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

本研究分析了c-Met的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果表明，c-Met的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期存在顯著相關(guān)性(分別為 P=0.017，P=0.000，P=0.000)，而與患者的性別、年齡、腫瘤細(xì)胞分化程度、腫瘤大小等無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，詳見表1。

3 討論

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)主要由成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞分泌。HGF與腫瘤細(xì)胞表面的c-Met受體結(jié)合后可以導(dǎo)致c-Met在Y1234和Y1235位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致下游多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，如Erk、Akt和Stat3等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移。既往研究［2］發(fā)現(xiàn)，c-Met及HGF在多種腫瘤組織中過表達(dá)，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。Kammula U S等［3］檢測(cè)了60例結(jié)腸癌組織中c-Met和HGF mRNA水平的表達(dá)，結(jié)果提示c-Met和HGF的過表達(dá)與結(jié)腸癌淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，并能影響患者預(yù)后。Nakamura Y等［4］檢測(cè)了130例肺腺癌組織中c-Met的表達(dá)，結(jié)果提示c-Met的過表達(dá)能通過配體依賴性和非配體依賴性2種途徑導(dǎo)致c-Met的活化，進(jìn)而影響腫瘤的組織學(xué)類型和分化程度。Seiwert T Y等［5-6］分析了121例頭頸部鱗癌組織中c-Met的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)c-Met在84%的頭頸部鱗癌組織中呈過表達(dá)，而c-Met抑制劑可以阻斷c-Met活化所導(dǎo)致的細(xì)胞增生、遷移及血管生成等生物學(xué)活性。Kim C H等［7］通過免疫組化技術(shù)檢測(cè)了61例舌鱗狀細(xì)胞癌組織中HGF和c-Met的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其陽性率分別為57.3%和54.1%，c-Met的表達(dá)與腫瘤分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及患者的生存期顯著相關(guān)，因此認(rèn)為c-Met能夠影響舌鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展及患者的預(yù)后。Yamamoto S等［8］通過免疫組化檢測(cè)了90例卵巢透明細(xì)胞癌組織中c-Met的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)c-Met在22%的腫瘤組織中呈過表達(dá)，并且c-Met的表達(dá)情況是患者生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。可見，c-Met過表達(dá)在多種腫瘤組織中普遍存在，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。

表1 c-Met的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.1 c-Met expression and its correlation with clinicopathological characteristics

最近的研究［6-8］發(fā)現(xiàn)，腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)所形成的微環(huán)境對(duì)食管鱗癌的生長和轉(zhuǎn)移具有重要作用，基質(zhì)中的腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞能夠影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。Grugan K D等［9］通過一個(gè)模擬體內(nèi)的三維器官型培養(yǎng)模型證實(shí)，腫瘤相關(guān)性成纖維細(xì)胞能夠通過分泌HGF促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞向基質(zhì)中的侵襲。另外，Ren Y等［10］通過ELISA檢測(cè)了149例食管鱗癌患者的血清HGF濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者治療前的血清HGF濃度顯著高于對(duì)照組，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及患者生存期相關(guān)，多變量分析提示血清HGF水平是細(xì)胞侵襲的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。這些研究均提示HGF/c-Met信號(hào)通路在食管鱗癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然而，目前關(guān)于c-Met在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其在食管鱗癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的作用少有報(bào)道。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了c-Met在87例食管鱗癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析了c-Met的過表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性。c-Met在33.3%的食管鱗癌組織中呈陽性表達(dá)，c-Met的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期存在顯著相關(guān)性，而與患者的性別、年齡、腫瘤細(xì)胞分化程度、腫瘤大小等無明顯相關(guān)性。這一結(jié)果提示，c-Met的高表達(dá)可以作為高侵襲性食管鱗癌的分子標(biāo)志物。

HGF/c-Met信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生和侵襲中均發(fā)揮關(guān)鍵作用，而阻斷HGF/c-Met可以抑制腫瘤細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移，因此，以c-Met為治療靶點(diǎn)已成為目前腫瘤治療研究中的熱點(diǎn)。Yoo B K等［11］對(duì)肝細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，c-Met抑制劑可以阻斷晚期轉(zhuǎn)錄因子SV40所介導(dǎo)的裸鼠成瘤和轉(zhuǎn)移，提出c-Met抑制劑可能成為肝細(xì)胞癌的新的治療措施。Xu H等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用c-Met抑制劑PF2341066和EGFR抑制劑吉非替尼可以顯著抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移，效果優(yōu)于2種藥物的單獨(dú)應(yīng)用，這一結(jié)果提示c-Met和EGFR的聯(lián)合阻斷可能成為頭頸部鱗癌的新的治療措施。Syed Z A等［13］通過體外及體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，阻斷HGF/c-Met/Stat3信號(hào)通路可以抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌的侵襲。Lau P C等［14］對(duì)鼻咽癌的體外研究發(fā)現(xiàn)，小分子酪氨酸激酶抑制劑PHA665752可以抑制c-Met的激活，從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。另外，Arriola E等［15］對(duì)小細(xì)胞肺癌的研究也發(fā)現(xiàn)，PHA665752可以阻斷HGF介導(dǎo)的c-Met磷酸化，從而抑制細(xì)胞增生和侵襲。迄今為止，關(guān)于阻斷HGF/c-Met信號(hào)通路對(duì)食管鱗癌生長及侵襲的研究尚未見報(bào)道，對(duì)這一問題的深入研究有望為食管鱗癌的治療找到新的靶點(diǎn)。

總之，本研究報(bào)道了HGF的受體c-Met在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)c-Met在部分食管鱗癌組織中呈高表達(dá)，且c-Met異常表達(dá)率增高與患者的腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期存在顯著相關(guān)性。這一結(jié)果提示，c-Met的高表達(dá)可以作為高侵襲性食管鱗癌的分子標(biāo)志物，c-Met有望成為食管鱗癌的新的治療靶點(diǎn)。

［1］Enzinger P C，Mayer R J.Esophageal cancer［J］.N Engl J Med，2003，349(23):2241-2252.

［2］Trusolino L，Bertotti A，Comoglio P M.MET signalling:principles and functions in development，organ regeneration and cancer［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2010，11(12):834-848.

［3］Kammula U S，Kuntz E J，F(xiàn)rancone T D，et al.Molecular co-expression of the c-Met oncogene and hepatocyte growth factor in primary colon cancer predicts tumor stage and clinical outcome［J］.Cancer Lett，2007，248(2):219-228.

［4］Nakamura Y，Niki T，Goto A，et al.c-Met activation in lung adenocarcinoma tissues:an immunohistochemical analysis［J］.Cancer Sci，2007，98(7):1006-1013.

［5］Seiwert T Y，Jagadeeswaran R，F(xiàn)aoro L，et al.The MET receptor tyrosine kinase is a potential novel therapeutic target for head and neck squamous cell carcinoma［J］.Cancer Res，2009，69(7):3021-3031.

［6］方文濤.第7版國際抗癌聯(lián)盟食管鱗癌TNM分期解讀［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，31(3):265-270.

［7］Kim C H，Koh Y W，Han J H，et al.c-Met expression as an indicator of survival outcome in patients with oral tongue carcinoma［J］.Head Neck，2010，32(12):1655-1664.

［8］Yamamoto S，Tsuda H，Miyai K，et al.Gene amplification and protein overexpression of MET are common events in ovarian clear-cell adenocarcinoma:their roles in tumor progression and prognostication of the patient［J］.Mod Pathol，2011，24(8):1146-1155.

［9］Grugan K D，Miller C G，Yao Y，et al.Fibroblast-secreted hepatocyte growth factor plays a functional role in esophageal squamous cell carcinoma invasion［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107(24):11026-11031.

［10］Ren Y，Cao B，Law S，et al.Hepatocyte growth factor promotes cancer cell migration and angiogenic factors expression:a prognostic marker of human esophageal squamous cell carcinomas［J］.Clin Cancer Res，2005，11(17):6190-6197.

［11］Yoo B K，Gredler R，Chen D，et al.c-Met activation through a novel pathway involving osteopontin mediates oncogenesis by the transcription factor LSF［J］.J Hepatol，2011，55(6):1317-1324.

［12］Xu H，Stabile L P，Gubish C T，et al.Dual blockade of EGFR and c-Met abrogates redundant signaling and proliferation in head and neck carcinoma cells［J］.Clin Cancer Res，2011，17(13):4425-4438.

［13］Syed Z A，Yin W，Hughes K，et al.HGF/c-Met/Stat3 signaling during skin tumor cell invasion:indications for a positive feedback loop［J］.BMC Cancer，2011，11:180.

［14］Lau P C，Wong E Y.Targeting MET by tyrosine kinase inhibitor suppresses growth and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell lines［J］.Pathol Oncol Res，2011，25［Epub ahead of print］.

［15］Arriola E，Canadas I，Arumi-Uria M，et al.MET phosphorylation predicts poor outcome in small cell lung carcinoma and its inhibition blocks HGF-induced effects in MET mutant cell lines［J］.Br J Cancer，2011，105(6):814-823.