梁 騎 焦艷梅 計云霞 李 田 吳 昊 張國元 唐 中*

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，南充 637100;2.首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染科，北京 100069)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)慢性感染是全球范圍的重要公共衛(wèi)生問題之一，全世界感染者已超過一億七千萬。由于血制品的廣泛應用，器官移植的興起及不良生活方式的蔓延等因素。我國的慢性HCV感染人數(shù)呈顯著上升趨勢。慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)由于其肝硬化和肝癌的發(fā)生率明顯高于慢性乙型肝炎，嚴重危害了人類的身體健康，而備受重視和關注［1］。近年來HCV感染慢性化的機制尤其是宿主的免疫因素成為研究的熱點。CD3+CD4－CD8－(double negative T，DNT)細胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一群免疫調(diào)節(jié)性T細胞，在正常人的外周血約占總淋巴細胞的1% ～5%，該DNT細胞表達Fas/FasL、TNF/TNFR，CD3+、CD4－、CD8－、MHC Ⅰ等［2］。DNT細胞在免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制、自身免疫及抗腫瘤方面具有非常重要的作用［2-5］。國內(nèi)外未見慢性HCV感染者中DNT細胞文獻的報道，為了解HCV感染者機體免疫狀態(tài)、免疫功能情況，探討細胞免疫在HCV感染者發(fā)病過程中的作用，本課題組用流式細胞儀對92例慢性HCV感染者的DNT細胞及T淋巴細胞亞群進行了檢測分析，報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究標本來源于2010年6月至2011年6月首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院感染科門診及住院患者，92例(男47例，女45例)慢性HCV感染患者年齡(28～66)歲，平均年齡(40±13)歲。另選首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院健康體檢者93例(男49例，女44例)，年齡(24～62)歲，平均年齡(32±9)歲，兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。病例選擇標準參考2004年丙型肝炎防治指南［6］:血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)反復升高，病程超過6個月;血清HCV RNA(RT-PCR法)和(或)抗HCV(ELISA法)陽性;排除其他病毒感染，包括甲型、乙型、戊型肝炎病毒和巨細胞病毒、EB病毒感染;排除自身免疫性肝炎、乙醇性肝病和代謝性肝病;近3個月內(nèi)未使用抗病毒藥物及免疫抑制劑。

1.2 方法

1.2.1 試劑

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)、聚蔗糖-泛影葡胺分層液(淋巴細胞分離液，F(xiàn)icoll，天津)，流式抗體:CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE三標記單克隆抗體購自美國BD公司。

1.2.2 儀器

流式細胞儀為美國BD公司生產(chǎn)的FACSCantotmⅡ型。

1.2.3 方法

取HCV感染者及健康者外周靜脈血1 mL，EDTA-K2抗凝。于每支試管中加入10 μL的三標記單克隆抗體 CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE，再加入50 μL抗凝靜脈血，充分混勻，25℃避光孵育20 min后，加入紅細胞溶解液250 μL，充分溶解紅細胞20 min后，以1 200 r/min的速度離心5 min，去上清，PBS緩沖液沖洗2次，最后以500 μL的PBS緩沖液懸浮細胞，流式細胞儀檢測10 000個淋巴細胞，各細胞亞群分別用百分比和絕對計數(shù)表示，百分比以T細胞的百分比表示，絕對計數(shù)則以細胞/mm3表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HCV感染者DNT細胞分布

慢性 HCV感染者 DNT細胞比例(8.57% ±6.16%)高于正常對照組(6.78% ±4.50%)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖1A)。慢性HCV感染者DNT細胞絕對數(shù)(102.82±85.19)/mm3和正常對照組(118.84±84.83)/mm3相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)(圖1B)。慢性HCV感染者DNT細胞流式散點圖見圖2A、B，正常健康對照組DNT細胞流式散點圖見圖2C、D。

圖1 慢性HCV感染者和正常對照組DNT細胞分布情況Fig.1 The distribution of DNT cells between chronic HCV infection and normal control group

2.2 T細胞亞群分布

慢性HCV感染者CD3+CD4－CD8+比例高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，慢性HCV感染者CD3+CD4+CD8－比例、CD4+/CD8+比值均低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，詳見表1。

圖2 CD3+CD4－CD8－(DNT)細胞流式散點圖Fig.2 The flow cytometric dot plots of CD3+CD4－CD8－(DNT)cell

表1 慢性HCV感染者和健康對照組T細胞亞群分布Tab.1 The distribution of T lymphocyte subsets between chronic HCV infection and normal control group

3 討論

最近的研究［2，4］表明，人類的 DNT 細胞具有免疫抑制功能，是一種新的免疫調(diào)節(jié)T細胞，通過清除同種同源性的CD8+T細胞和產(chǎn)生IL-4和IL-10等途徑對機體起抑制性免疫調(diào)節(jié)作用。從轉(zhuǎn)基因小鼠中純化出的DNT細胞可直接清除同種同源性的CD8+T細胞，從普通B57BL/6小鼠、fas基因突變的Ipr小鼠和fasl基因突變的gld小鼠中分離出的DNT細胞，可殺傷已被激活的同種同源性的 CD8+T細胞［2，7］;體外的研究［7］亦表明，人類DNT細胞在體外被激活后可產(chǎn)生IL-4和IL-10，對機體起抑制性免疫調(diào)節(jié)作用。

本文實驗結(jié)果顯示慢性HCV感染者DNT細胞比例明顯高于正常對照組，提示DNT細胞的異常表達可能參與了慢性HCV疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，推測其可能通過抑制輔助性T細胞，使機體免疫功能降低，導致病情的加重或病毒持續(xù)感染，使HCV感染慢性化。另一原因可能是感染HCV后，CD4+細胞急劇減少，DNT細胞加速增生補償 CD4+有關，但對慢性HCV感染者DNT細胞確切的作用及機制目前還不明確，有待于進一步研究。

在HCV的病理生理中，宿主的免疫狀態(tài)是決定病情發(fā)展的關鍵因素之一。機體維持正常的免疫功能狀態(tài)，有賴于T淋巴細胞及其亞群之間的相互協(xié)調(diào)或制約，如果這些細胞的功能和數(shù)量發(fā)生變化，則可視為免疫功能紊亂，這些均與疾病的發(fā)生發(fā)展有關。本實驗結(jié)果顯示慢性HCV感染者CD3+CD4－CD8+(殺傷性 T細胞)比例高于健康對照組，而 CD3+CD4+CD8－(輔助性 T細胞)比例、CD4+/CD8+比值均低于健康對照組，這和劉毓剛等［9］報道一致。HCV感染后引起T細胞亞群的這種變化，可能是HCV感染慢性化的重要原因之一，迄今為止，HCV的致病機制仍不很清楚，目前不少學者認為細胞免疫可能是HCV發(fā)病的主要機制［10-11］。其主要依據(jù)是:①丙型肝炎肝組織特征性的病理改變之一為匯管區(qū)淋巴細胞聚集或形成濾泡，甚至出現(xiàn)生發(fā)中心。② HCV感染的肝細胞周圍有許多的淋巴細胞和單核細胞，有的被感染細胞還和淋巴細胞連在一起。③ CHC患者HCV致敏的CD8+T細胞能溶解自身的肝細胞，具有抗原特異性的CD4+T細胞在清除HCV及致病過程中發(fā)揮著重要作用。兩者比例發(fā)生變化后有可能導致兩種細胞不能很好地協(xié)調(diào)作用，從而影響了機體清除HCV的能力，導致HCV感染的持續(xù)。

綜上所述，CHC患者DNT細胞百分比顯著升高及T淋巴細胞亞群比例改變，可能是導致HCV感染慢性化的重要原因之一。

［1］Irshad M，Ansari M A，Singh A，et al.HCV-genotypes:a review on their origin，global status，assay system，pathogenecity and response to treatment［J］.Hepatogastroenterology，2010，57(104):1529-1538.

［2］張竹虛，張麗.αβ-TCR+CD3+CD4 CD8雙陰性T細胞:一種新發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)T細胞［J］.現(xiàn)代免疫學，2004，24(1):5-8.

［3］Thomson C W，Lee B P，Zhang L.Double-negative regulatory T cells:non-conventional regulators［J］.Immunol Res，2006，35(1-2):163-178.

［4］Kim E Y，Juvet S C，Zhang L.Regulatory CD4(－)CD8(－ )double negative T cells［J］.Methods Mol Biol，2011，677:85-98.

［5］Feyler S，von Lilienfeld-Toal M，Jarmin S，et al.CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)regulatory T cells are increased whilst CD3(+)CD4(－)CD8(－)alphabetaTCR(+)Double Negative T cells are decreased in the peripheral blood of patients with multiple myeloma which correlates with disease burden［J］.Br J Haematol，2009，144(5):686-695.

［6］中華醫(yī)學會肝病學分會、中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會.丙型肝炎防治指南［J］.中華肝臟病雜志，2004，12(4):194-198.

［7］Zhang Z X，Yang L，Young K J，et al.Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression［J］.Nat Med，2000，6(7):782-789.

［8］Sakaguchi S.Regulatory T cells:key controllers of immunologic self-tolerance［J］.Cell，2000，101(5):455-458.

［9］劉毓剛，王天然，李國良.HCV感染者外周血T淋巴細胞亞群的變化［J］.四川醫(yī)學，2010，31(2):241-242.

［10］Mccaughan G W，Bowen D G.Pathogenesis of cholestatic hepatitis C［J］.J Hepatol，2011，54(2):392-394.

［11］Accapezzato D，F(xiàn)rancavilla V，Paroli M，et al.Hepatic expansion of a virus-specific regulatory CD8(+)T cell population in chronic hepatitis C virus infection［J］.J Clin Invest，2004，113(7):963-972.