林 媛 李積鳳 劉 杰 牛夢林 孫 然 王 軍 劉 巖 王 辰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京市呼吸和肺循環(huán)疾病重點(diǎn)實(shí)驗室，北京呼吸疾病研究所，北京 100020;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，北京 100069;3.衛(wèi)生部北京醫(yī)院，北京 100730;4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心外科，北京 100020)

纖維蛋白原(fibrinogen)由Aα、Bβ、γ三對多肽鏈組成，分別由3個獨(dú)立的基因編碼:FGA、FGB和FGG［1］。其中Bβ鏈的合成是整個分子合成的限速步驟［2］，且Bβ鏈基因多態(tài)性是導(dǎo)致個體間血漿纖維蛋白原水平差異的重要遺傳因素，同時也與心腦血管疾病存在密切的相關(guān)性。BβArg448Lys是纖維蛋白原較常見的基因多態(tài)性之一，相關(guān)研究表明BβArg448Lys與心肌梗死［3］、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)［4］及中國香港人高血壓［5］的發(fā)病有關(guān)。BβArg448Lys的位置靠近以下3個重要區(qū)域:預(yù)測的β鏈聚合點(diǎn)、β鏈和α鏈羧基端結(jié)合的區(qū)域及β鏈的鈣離子結(jié)合部位，這3個區(qū)域在纖維蛋白聚合過程中起重要作用［6-7］，故推測此突變位點(diǎn)參與調(diào)節(jié)纖維蛋白聚合進(jìn)而影響纖維蛋白凝塊的結(jié)構(gòu)與功能。以往有關(guān)BβArg448Lys基因多態(tài)性的研究多集中于病例對照研究，但一個基因位點(diǎn)的突變能否真正影響整個纖維蛋白原分子的功能，需要進(jìn)一步的功能學(xué)實(shí)驗證據(jù)。而功能學(xué)研究的重要步驟之一就是要構(gòu)建纖維蛋白原穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。為此本研究通過借助體外重組技術(shù)，探討了構(gòu)建野生型(BβArg448)和突變型(BβLys448)纖維蛋白原穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的方法，為探討B(tài)βArg448Lys所致纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)與功能異常奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為其相關(guān)血栓性疾病的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、宿主菌、細(xì)胞

人纖維蛋白原Aα鏈全長cDNA、Bβ鏈全長cDNA、γ鏈全長 cDNA的表達(dá)載體 pRSV-FGA、pMLPFGB、pRSV-FGG均由美國北卡羅來納大學(xué)教堂山分校Susan T.Lord教授惠贈。宿主菌E.coli DH5α及CHO-K1細(xì)胞均為本實(shí)驗室保存。

1.1.2 主要試劑

脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)購自 Invitrogen公司;G418購自北京欣經(jīng)科生物科技有限公司;組氨醇(Histidinol)、RNA提取試劑TRIzol購自Sigma公司;DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;AMV反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶Dpn I、Pfu Turbo DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、600 bp DNA marker購自TaKaRa公司;QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit購自Stratagene公司;質(zhì)粒大量提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;PCR引物均由Invitrogen公司合成;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 定點(diǎn)突變構(gòu)建人工突變體 BβLys448的表達(dá)載體pMLP-FGB(448A)

根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計并合成一對互補(bǔ)引物，上游引物:5'-GGAAGGGGTCATGGTACTCAATGAAGAAGATGAGTATG-3';下游引物:5'-CATACTCATCTTCTTCATTGAGTACCATGACCCCTTCC-3'，以 pMLP-FGB(448G)為模板，按照QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit方法，PCR擴(kuò)增人工突變體BβLys448的表達(dá)載體pMLP-FGB(448A)。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s，55℃退火1 min，68℃延伸10 min，共12個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI在37℃下酶切1 h，直接取1 μL酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后挑白斑單菌落培養(yǎng)擴(kuò)增，保存菌株，提取質(zhì)粒并送Invitrogen公司測序鑒定。

1.2.2 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

將CHO-K1細(xì)胞置于含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中，接種于直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中，5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80% ～90%時，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

首先將正常CHO-K1細(xì)胞接種于24孔板，檢測G418的1周最小致死濃度，重復(fù)3次，確定細(xì)胞G418的1周最小致死濃度為600 mg/L。

8 μg DNA(4 μg pRSV-FGA+4 μg pRSV-FGG)及 16 μL脂質(zhì)體分別溶于200 μL無血清培養(yǎng)基，混勻室溫靜置5 min，混合稀釋的DNA和脂質(zhì)體，室溫靜置20 min，移去細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)含血清的正常培養(yǎng)基，PBS清洗后替換為4.6 mL無血清培養(yǎng)基，將稀釋的DNA與脂質(zhì)體的混合物加入培養(yǎng)皿中，輕輕混勻。5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)4 h后將無血清培養(yǎng)基更換為10 mL完全培養(yǎng)基。24 h后將細(xì)胞1∶10稀釋接種于10個直徑為100 mm的培養(yǎng)皿中。24 h后更換培養(yǎng)液，加G418(600 mg/L)，每2 d換液1次，1周后改用200 mg/L的G418維持篩選，4周后抗性克隆初步形成。顯微鏡下挑出單個細(xì)胞集落于24孔板中，并對應(yīng)標(biāo)記，避免單克隆之間的污染，分別逐步擴(kuò)大培養(yǎng)。每個單克隆細(xì)胞株分別做RT-PCR鑒定，檢測出同時顯示表達(dá)纖維蛋白原Aα鏈與γ鏈的單克隆細(xì)胞株，繼而擴(kuò)大培養(yǎng)，維持G418(200 mg/L)選擇壓力，每3 d換液或傳代，即得到穩(wěn)定表達(dá)纖維蛋白原Aα鏈與γ鏈的細(xì)胞株CHO-K1-Aα-γ。

同理，將 CHO-K1-Aα-γ細(xì)胞接種于24孔板，檢測組氨醇的1周最小致死濃度，重復(fù)3次，確定細(xì)胞組氨醇的1周最小致死濃度為300 mg/L。

按上述方法將 pMLP-FGB(448G)8 μg、pMLP-FGB(448A)8 μg分別轉(zhuǎn)染于 CHO-K1-Aα-γ 細(xì)胞，加組氨醇300 mg/L，G418 200 mg/L，每2 d換液1 次，1 周后改用組氨醇100 mg/L，G418 200 mg/L維持篩選，4周后同時抗組氨醇與G418的抗性克隆初步形成。在細(xì)胞密度達(dá)80%時，移至培養(yǎng)瓶中傳代擴(kuò)增，維持組氨醇100 mg/L+G418 200 mg/L的選擇壓力，每3 d換液或傳代，從而培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)野生型(BβArg448)與突變型(BβLys448)纖維蛋白原的細(xì)胞系CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)。

1.2.3 RT-PCR鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

收集持續(xù)傳代的穩(wěn)定表達(dá)野生型與突變型纖維蛋白原細(xì)胞株 CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHOK1-fibrinogen(BβLys448)和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞，根據(jù)TRIzol一步法分別提取細(xì)胞總RNA，用全波長酶標(biāo)儀和瓊脂糖電泳檢測RNA純度、濃度及完整性。采用TaKaRa試劑盒，以(Oligo)dT為引物，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，－20℃保存?zhèn)溆没蛄⒖逃糜赑CR。在20 μL反應(yīng)體系中加入cDNA 模板 1 μL，10 × PCR 緩沖液 2.0 μL，dNTP(25 mmol/L)1.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL，ExTaq DNA 多聚酶0.1 μL，H2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min，置4℃保溫。取等體積RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行紫外成像。

FGA上游引物:5'-ATCTGCCTGCAAAGATTCAGAC-3'，下游引物:5'-CCTACTGCATGACCCTCGAC-3';FGB上游引物:5'-ATCCCAACTAACCTTCGTGTG-3'，下游引物:5'-TCTTGACGGTTCTGAATCACT-3';FGG上游引物:5'-TCAAGACATTGCCAATAAGGGA-3'，下游引物:5'-GTCACTAGGATCATCGCCAA-3'。

2 結(jié)果

2.1 突變型BβLys448纖維蛋白原表達(dá)載體pMLPFGB(448A)質(zhì)粒的鑒定

DNA測序結(jié)果(圖1)顯示FGB448位堿基序列已由原來編碼精氨酸(Arg)的AGG成功地突變?yōu)榫幋a賴氨酸(Lys)的AAG，且無其他基因的錯讀及錯配。表明成功構(gòu)建了人工突變體pMLP-FGB(448A)。

圖1 野生型(A)與突變型(B)纖維蛋白原表達(dá)載體pMLP-FGB核苷酸序列比對Fig.1 Nucleotide blast of wild type(A)and mutant type(B)fibrinogen expression vector pMLP-FGB

2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選

pRSV-FGA及pRSV-FGG轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，G418維持篩選后，抗 G418(圖2A)細(xì)胞克隆初步形成。RT-PCR鑒定篩選出同時表達(dá)纖維蛋白原Aα鏈與γ鏈的單克隆細(xì)胞株，繼而轉(zhuǎn)染pMLP-FGB(448G)/pMLP-FGB(448A)，G418與組氨醇維持篩選后，同時抗G418與組氨醇(圖2B、C)的細(xì)胞克隆初步形成。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 CHO-K1-Aα-γ、CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)鑒定結(jié)果

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選Fig.2 Screening of stably transfected cell clones

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CHO-Aα-γRT-PCR結(jié)果顯示，可以擴(kuò)增得到FGA 427 bp及FGG 445 bp的特異性條帶(圖 3)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)(野生型)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)(突變型)RT-PCR結(jié)果顯示，可以擴(kuò)增得到FGA 427 bp、FGB 290 bp及FGG 445 bp的特異性條帶(圖4、5)，且全部經(jīng)測序確定。而在未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO細(xì)胞中，F(xiàn)GA、FGB、FGG均未有mRNA水平的表達(dá)，表示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系CHO-K1-Aα-γ、CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)、CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)在轉(zhuǎn)錄水平構(gòu)建成功。

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞(CHO-K1-Aα-γ)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞RT-PCR檢測結(jié)果Fig.3 RT-PCR results of stable transfected cells CHO-K1-Aα-γ and untransfected CHOK1 cells

圖4 野生型纖維蛋白原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞CHOK1-fibrinogen(BβArg448)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞RT-PCR檢測結(jié)果Fig.4 RT-PCR results of stable transfected cells CHO-K1-fibrinogen(BβArg448)and untransfected CHO-K1 cells

圖5 突變型纖維蛋白原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞CHOK1-fibrinogen(BβLys448)與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO-K1細(xì)胞RT-PCR檢測結(jié)果Fig.5 RT-PCR results of stable transfected cells CHO-K1-fibrinogen(BβLys448)and untransfected CHO-K1 cells

3 討論

纖維蛋白原(fibrinogen)是一種相對分子質(zhì)量為340 000的糖蛋白，由肝細(xì)胞合成并分泌。每一個纖維蛋白原分子由3對非等同的多肽鏈Aα，Bβ和γ組成［8］。纖維蛋白原作為凝血系統(tǒng)中含量最高的凝血因子，是凝血系統(tǒng)的主要成分，是整個凝血過程的底物［9］。

纖維蛋白原的基因多態(tài)性與多種疾病的發(fā)生相關(guān)［10-11］。BβArg448Lys是纖維蛋白原研究較多的基因多態(tài)性之一。Behague I等［4］通過血管造影術(shù)評估冠狀動脈疾病患者(CAD)時發(fā)現(xiàn)，三支血管病變的病人BβLys448等位基因頻率高于雙支、單支血管病變的CAD患者。Carter A M等［12］對305例急性腦卒中患者及197例健康對照進(jìn)行的病例研究發(fā)現(xiàn)，BβArg448Lys位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率在女性腦卒中患者組與女性健康對照組之間存在明顯差異，且不依賴于纖維蛋白原水平的變化，推測BβArg448Lys可能導(dǎo)致纖維蛋白原分子結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而改變纖維蛋白凝塊結(jié)構(gòu)，形成更堅固或更不易被纖溶酶溶解的纖維蛋白凝塊。也有報道［13］表明，纖維蛋白凝塊的結(jié)構(gòu)受基因因素影響，且多于三分之一由基因變異所致。但一項包含2組人群(一組為3 657名心肌梗死患者與1 211例正常對照組;另一組為1 392名正常心肌梗死患者與1 392名對照組)的大樣本病例對照研究證實(shí)，BβArg448Lys與心肌梗死沒有明顯相關(guān)性［14］。Theodoraki E V 等［15］也認(rèn)為在希臘人中，BβArg448Lys基因多態(tài)性與CAD的發(fā)病危險性無相關(guān)性。關(guān)于BβArg448Lys對纖維蛋白原的結(jié)構(gòu)影響報道不一，有研究［16］表明 BβLys448基因型血漿標(biāo)本形成的凝塊結(jié)構(gòu)較BβArg448基因型更緊密，有研究［17］則否認(rèn)這一相關(guān)性。因此，纖維蛋白原BβArg448Lys基因多態(tài)性所致的纖維蛋白原功能學(xué)的改變待進(jìn)一步深入研究，以豐富人類基因庫，為相關(guān)的疾病提供基礎(chǔ)資料，且亟待進(jìn)一步用體外重組等方法探討其機(jī)制，為疾病的病因提出新的學(xué)說。

而要體外重組構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染纖維蛋白原BβArg448Lys野生型及突變型細(xì)胞系，是研究纖維蛋白原BβArg448Lys基因多態(tài)性所致的纖維蛋白原功能學(xué)改變的關(guān)鍵步驟。為此，本研究采用兩步法構(gòu)建野生型及突變型纖維蛋白原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。本研究采用CHO-K1細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞是因為CHO-K1細(xì)胞是用于外源蛋白表達(dá)常見的哺乳動物細(xì)胞，具有外源蛋白質(zhì)表達(dá)穩(wěn)定，易于規(guī)?；囵B(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，且由于正常CHO-K1細(xì)胞株不表達(dá)纖維蛋白原，因此CHO-K1細(xì)胞是纖維蛋白原專一表達(dá)的合適宿主細(xì)胞。

本研究先將編碼纖維蛋白原Aα鏈及γ鏈的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入CHO-K1細(xì)胞，二者為新霉素抗性，G418抗性克隆細(xì)胞經(jīng)RT-PCR鑒定篩選獲得同時具有Aα鏈及γ鏈mRNA水平表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。在此基礎(chǔ)上再分別轉(zhuǎn)染編碼野生型及突變型纖維蛋白原Bβ鏈的質(zhì)粒(帶組氨醇篩選標(biāo)簽)，同時抗G418及組氨醇的細(xì)胞克隆擴(kuò)增培養(yǎng)并經(jīng)RT-PCR鑒定同時具有纖維蛋白原Aα鏈、γ鏈、野生型/突變型Bβ鏈mRNA水平表達(dá)。此外考慮到目的基因可能由于同源重組置換了原有的轉(zhuǎn)基因，本實(shí)驗在無G418及組氨醇維持培養(yǎng)構(gòu)建的纖維蛋白原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系3月后重復(fù)檢測，仍可檢測到Aα鏈、γ鏈、野生型/突變型Bβ鏈mRNA水平表達(dá)，表明外源性野生型/突變型人纖維蛋白原已穩(wěn)定整合和表達(dá)。當(dāng)然本轉(zhuǎn)染體系仍面臨一些問題，如啟動子之間有可能由于競爭或飽和作用造成目的基因的表達(dá)不均衡，但纖維蛋白原三條鏈的合成速率與表達(dá)量本身就不均衡［18］，且不影響重組纖維蛋白原的功能及純化。

綜上所述，本研究成功建立了在mRNA水平穩(wěn)定表達(dá)野生型(BβArg448)和突變型(BβLys448)纖維蛋白原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，為獨(dú)立考察纖維蛋白原BβArg448Lys基因多態(tài)性及與纖維蛋白凝塊的結(jié)構(gòu)及功能的關(guān)系提供了理想的細(xì)胞模型，使直接對BβArg448Lys的功能學(xué)研究成為可能，為相關(guān)疾病的研究提供有用工具。

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