徐 靜 張建平 王清濤

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院檢驗科，北京 100020)

血清酶測定是臨床實驗室的一項重要常規(guī)工作，但由于酶的催化活性不僅取決于酶的含量，還受多種因素的影響，具有方法依賴性，對酶活性測定進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化是解決這一問題的最好方法［1］。目前，國際臨床化學(xué)學(xué)會(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)已經(jīng)公布了丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine-aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate-aminotransferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)、淀粉酶(amylase，AMY)6個血清酶測定的參考方法［2-7］。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面，目前歐共體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM)以及日本臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)委員會(Japan Committee for Clinical Laboratory Standards，JCCLS)均研制了酶的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。國內(nèi)多家實驗室已經(jīng)建立了酶的國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)推薦的參考方法，酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制也在進(jìn)行中，考慮到互通性，酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最好為人源性血清標(biāo)本，而用冰凍人血清制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可行性也得到了美國國家疾病控制中心的認(rèn)可［8］。本實驗室將收集的人血清按照GGT不同濃度進(jìn)行過濾分裝，制備了GGT冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了觀察，以研究此血清制備方法的可行性和GGT冰凍混合血清－80℃貯存條件下的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 GGT冰凍混合人血清的制備

①體檢血清:收集當(dāng)日體檢結(jié)果正常，且無溶血、黃疸及乳糜的血清標(biāo)本，－80℃冰箱保存。②患者血清:按 GGT結(jié)果50～200 U/L、200～400 U/L、400～750 U/L、＞750 U/L濃度范圍分別收集患者新鮮血清，避免溶血、黃疸及乳糜。－80℃冰箱保存。

1.2 儀器

GAST DOA型真空/加壓兩用過濾泵(美國)，全波過濾器，分析濾紙，賽多利斯0.8 μm醋酸纖維素膜(德國Sartorius公司)，賽多利斯0.45 μm醋酸纖維素膜(德國 Sartorius公司)，賽多利斯 0.2 μm 醋酸纖維素膜(德國 Sartorius公司)，BIOHIT 100 ～5 000 μL 單道電動移液器(芬蘭)，凍存盒，磁力攪拌器，Siemens Dimension RXL Max全自動生化分析儀。

1.3 冰凍混合人血清制備方法

1)確定濃度:制備5個濃度水平的GGT冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，各濃度分別為＜50 U/L、50～100 U/L、101 ～200 U/L、201 ～300 U/L、301 ～400 U/L，每個濃度水平制備約600 mL。分裝1 mL/支，每個濃度約500支。

2)血清復(fù)融:在過濾前一天將需要過濾的血清在室溫融化，將收集的同一濃度范圍的血清混勻，用常規(guī)方法測定其濃度。根據(jù)其濃度水平確定最終混合比例，再用常規(guī)方法測定其濃度，達(dá)到確定的濃度水平后放4℃冰箱保存。

3)玻璃器皿及凍存管:將過濾用的容器洗刷干凈，與凍存管一同消毒后備用。

4)將前一天融好的血清從4℃冰箱中取出，在生物安全柜中進(jìn)行負(fù)壓抽吸過濾，血清依次經(jīng)過分析濾紙，0.8 μm 濾膜，0.45 μm 濾膜，0.2 μm 濾膜過濾。

5)將過濾好的血清在生物安全柜中進(jìn)行分裝，1 mL/支。－80℃冰箱保存。

1.4 冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性觀察

1)材料:①GGT冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):經(jīng)過濾分裝制備的5個濃度水平的混合人血清。②質(zhì)控血清:RANDOX常規(guī)化學(xué)質(zhì)控血清1和2(批號分別為496UN和331UE)，分別將其進(jìn)行0.5 mL/支分裝，用于監(jiān)測儀器及試劑狀態(tài)。③儀器和試劑:Siemens Dimension RXL Max全自動生化分析儀，Siemens GGT檢測試劑盒，Siemens enzyme校準(zhǔn)品。

2)方法:分別于候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備后0、7、30、60、120、180、330、360、390、750 d 采用 Siemens Dimension RXL Max全自動生化分析儀測定RANDOX質(zhì)控血清1、2(QC1、QC2)及采用隨機(jī)方法抽取的5個濃度水平的候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各1支，分別記錄為 C1、C2、C3、C4、C5。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Microsoft Office Excel 2007軟件抽取隨機(jī)樣本并進(jìn)行趨勢分析，采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

RANDOX質(zhì)控血清QC1、QC2和候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)C1、C2、C3、C4、C5 在 0、7、30、60、120、180、330、360、390、750 d的測定結(jié)果見表1。

表1 RANDOX質(zhì)控血清和候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GGT測定結(jié)果Tab.1 RANDOX qc serum and candidate standard material GGT determination result (U/L)

RANDOX質(zhì)控血清和候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性曲線見圖1，從圖1可以看到對于經(jīng)驗?zāi)Ｐ头椒?，QC1、QC2、C1～C5的斜率 b分別為 －0.127 8，－0.442 4，0.060 6，－0.042 4，－0.084 8，0.484 8，0.006 1，均接近0，即質(zhì)控血清和候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同時間的GGT測定結(jié)果沒有明顯變化趨勢。

根據(jù)ISO Guide35，采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件對QC1、QC2、C1～C5進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果顯示在750 d以內(nèi)，QC1、QC2、C1～C5線性回歸分析的 P 值均 ＞0.05(QC1、QC2、C1 ～C5測定結(jié)果P值分別為0.560、0.114、0.886，0.753，0.585，0.571，0.945)，即差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，所以GGT冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在此時間階段是穩(wěn)定的。

圖1 GGT冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性Fig.1 Stability of GGT frozen mixed human serum candidate standard material

3 討論

臨床檢驗結(jié)果準(zhǔn)確一直是檢驗醫(yī)學(xué)界的工作目標(biāo)。實現(xiàn)檢驗結(jié)果準(zhǔn)確的重要手段是建立和保證檢驗結(jié)果的溯源性，而開展檢驗量值溯源的必要條件是具備參考系統(tǒng)［9］，后者包括參考測量程序，從事參考測量的實驗室及參考物質(zhì)。而由參考方法定值，具有不同水平參考值結(jié)果的患者混合血清盤可以作為“企業(yè)一級參考品”，即企業(yè)的最高標(biāo)準(zhǔn)。這種定值血清分裝成小包裝，－70℃保存，應(yīng)該與新鮮血清性質(zhì)相似，但對其穩(wěn)定性的研究甚少。從減少基質(zhì)效應(yīng)的角度出發(fā)，校準(zhǔn)品最好為人源血清標(biāo)本。

采用感染篩查陰性的人血清或類人血清標(biāo)本，添加外源性替代物，如加入與人血清酶具有相似特性，從動物臟器中提取的酶或重組人源性酶制品制備校準(zhǔn)品具有基質(zhì)效應(yīng)小、良好的互換性和感染可能性小等優(yōu)點而成為一種可行的方案［10］。本實驗室制備的GGT冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的血清來源為實驗室檢測剩余的體檢者及患者血清，主要存在的問題是來源有限及可能具有感染性，最好在對收集的血清混勻后測定HIV和肝炎標(biāo)志物，以進(jìn)行感染篩查，而本研究并未進(jìn)行此測定。但本實驗室采用的混合血清制備方法比較簡單，除生物安全柜外，無需特殊設(shè)備，可操作性強。

穩(wěn)定性觀察分為短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性，有2種基本實驗設(shè)計，即經(jīng)典穩(wěn)定性研究和同步穩(wěn)定性研究，經(jīng)典穩(wěn)定性研究中，同時(如同一批次)制備的樣品在同樣的條件下隨著時間變化進(jìn)行測量，同步穩(wěn)定性研究是使所有穩(wěn)定性研究的測量在重復(fù)性條件下進(jìn)行，其不確定度相對較小［11］。本實驗室曾采用同步穩(wěn)定性研究方法進(jìn)行6種冰凍混合血清酶(ALP、ALT、AST、GGT、CK、LDH)的短期穩(wěn)定性觀察，對于GGT，其在室溫和2℃ ～8℃冷藏條件下30 d內(nèi)穩(wěn)定［12］。對于長期穩(wěn)定性的觀察，我們采用經(jīng)典穩(wěn)定性研究方法，并采用直線作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，即斜率b應(yīng)為0或接近0的方法觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個濃度水平GGT混合血清在不同時間的測定結(jié)果沒有明顯變化趨勢。采用線性回歸方差分析方法對其進(jìn)行分析，得到相同的結(jié)果，因此在750d穩(wěn)定性的觀察中，5個濃度水平的GGT冰凍混合人血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在－80℃保存條件下是穩(wěn)定的。

綜上所述，雖然本實驗室在血清來源方面缺乏感染篩查，無法保證制備的混合血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不存在感染性，但采用的混合血清制備方法簡便易行，且制備候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性良好。此血清候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備方法及穩(wěn)定性研究方案可以應(yīng)用于其他項目，但須注意感染性問題，因此血清來源仍是一個需要解決的問題。

［1］張克堅，楊振華.臨床酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化的新途徑［J］.中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1999，22(1):54-56.

［2］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 2.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of creatine kinase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(6):635-642.

［3］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 3.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(6):643-648.

［4］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement o f catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 4.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alanine aminotransferase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(7):718-724.

［5］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activi-ty concentrations of enzymes at 37℃.Part 5.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of aspartate aminotransferase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(7):725-733.

［6］Schumann G，Bonora R，Ceriotti F，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37℃.Part 6.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of γ-glutamyltransferase［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40(7):734-738.

［7］Schumann G，Aoki R，F(xiàn)errero C A，et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37℃.Part 8.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of α-Amylase［J］.Clin Chem Lab Med，2006，44(9):1146-1155.

［8］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Preparation and Validation of Commutable Frozen Human Serum Pools as Secondary Reference Materials for Cholesterol Measurement Procedures;Approved Guideline［S］.C37-A.Wayne，PA:NCCLS:1999.

［9］陳文祥.臨床檢驗量值溯源與參考系統(tǒng)［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(1):17-19.

［10］徐國賓，吳南，王清濤.要重視血清酶學(xué)測定的標(biāo)準(zhǔn)化工作［J］.臨床檢驗雜志，2007，25(3):161-164.

［11］中國合格評定國家認(rèn)可委員會.CNAS-CL04 2007標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品生產(chǎn)者能力認(rèn)可準(zhǔn)則［S］.2007.

［12］馬懷安，王清濤，徐靜，等.六種冰凍混合血清酶學(xué)的短期同步穩(wěn)定性研究［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2009，11(4):644-646.