田穎剛，王春艷，黃宇玫，廖春艷，張 盼，朱 勝，喬娟娟

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;

2.南昌大學科學技術學院，江西南昌 330029)

泰和烏骨雞活性肽對5- 氟尿嘧啶誘導HSF細胞損傷的保護作用

田穎剛1，王春艷1，黃宇玫2，廖春艷1，張 盼1，朱 勝1，喬娟娟1

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047;

2.南昌大學科學技術學院，江西南昌 330029)

目的:用單細胞凝膠電泳技術(SCGE)研究泰和烏骨雞活性肽對5－氟尿嘧啶(5－FU)損傷細胞DNA的保護作用。方法:傳代培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞(HSF)，隨機分為正常對照組，5－FU組，5－FU+泰和烏骨雞活性肽組。應用MTT法檢測細胞存活率，單細胞凝膠電泳法(SCGE)檢測5－FU引起HSF細胞DNA損傷程度，羥脯氨酸試劑盒檢測細胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量。結果:與正常對照組比較:5－FU組HSF細胞DNA的損傷程度較嚴重，且尾長、尾距、Olive尾距和尾部DNA百分含量顯著增加(p＜0.001)，細胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量顯著性減少(p＜0.05)。與5－FU組比較，泰和烏骨雞活性肽組細胞的尾長、尾距、Olive尾距和尾部DNA百分含量均顯著性減少(p＜0.001)，而細胞培養(yǎng)液上清中羥脯氨酸含量升高(p＜0.01)。結論:泰和烏骨雞活性肽對HSF細胞DNA損傷具有保護作用，泰和烏骨雞活性肽可以劑量依賴性地降低5－FU誘導的HSF細胞DNA的斷裂損傷。

泰和烏骨雞，活性肽，5－氟尿嘧啶，DNA損傷，單細胞凝膠電泳

5－氟尿嘧啶(5－fluorouracil，5－FU)為臨床常用的抗代謝類腫瘤治療藥物，因其代謝轉(zhuǎn)化為5－氟脫氧尿嘧啶核甘酸(FDUMP)，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)，從而抑制腫瘤細胞DNA復制合成，造成DNA損傷，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［1］，該過程同樣會作用于正常細胞，如抑制成纖維細胞的增殖和膠原的合成，延遲傷口愈合［2－5］。因此需要通過改變給藥方式、修飾化療藥物結構或者給予適當?shù)慕舛緞┡湮榈确椒▉硖岣?－FU選擇性且降低其臨床毒副作用。研究表明，應用生長激素、谷氨酰胺能提高吻合口愈合強度，促進術后早期腹腔化療條件下結腸吻合口愈合［6－7］。泰和烏骨雞是我國特有的藥食兩用滋補雞種，傳統(tǒng)中醫(yī)認為烏骨雞能補虛勞羸弱，滋陰清熱，治消渴心腹痛，益產(chǎn)婦，治女人崩中帶下、一切虛損諸病，其臨床療效已被廣為證實［8］。本課題組研究證明泰和烏骨雞活性肽具有非酶糖基化抑制作用［9］，良好的抗氧化作用［10］和一定程度的補血作用［11］。本文采用對DNA斷裂損傷較敏感的單細胞凝膠電泳技術探討泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導人皮膚成纖維細胞DNA損傷的保護作用，以期為烏骨雞功能活性的研究和臨床應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泰和烏骨雞活性肽 由新鮮的泰和烏骨雞，經(jīng)脫毛、去內(nèi)臟、絞成肉泥，然后采用蛋白酶酶解制得(詳見專利［12］);人皮膚成纖維細胞 美國標準菌種收藏所(ATCC)編號為842;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司;羥脯氨酸試劑盒 南京建成生物公司;四甲基偶氮唑藍(MTT) sigma公司;5－氟尿嘧啶 上海旭東海普藥業(yè)有限公司;胰蛋白酶 北京博大泰克生物基因技術有限責任公司;EDTANa2、Hepes 北京索萊寶科技有限公司;正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖、溴化乙錠、Tris 生工生物工程(上海)有限公司; 96、6和12孔細胞培養(yǎng)板(平底) 美國Costor。

MK3型酶標儀 上海熱電儀器有限公司; IDX－35B型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;BHC－1300ⅡA/B3型生物安全柜 蘇凈集團安泰公司; BDS200型倒置顯微鏡 北京福凱儀器有限公司; WJ－80A－111型二氧化碳培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;Ti－U型熒光倒置顯微鏡 日本尼康公司;SIMS00000型Milli－Q50超純水凈化系統(tǒng)

美國Millipore公司;DYY－Ⅲ2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCP－31B型電泳槽 北京市六一儀器廠;彗星圖象分析軟件(Casp－1.2.2)。

1.2 實驗方法

1.2.1 人成纖維細胞的培養(yǎng) 將HSF細胞按5×105個/mL接種在DMEM高糖培養(yǎng)基中(pH7.4，含10% FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10μmol/mL Hepes緩沖液、2μmol/mL L－谷氨酰胺)，二氧化碳培養(yǎng)箱溫育(37℃、5%CO2)。細胞為梭型貼壁生長，每2～3d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 5－FU損傷模型建立 取對數(shù)生長期HSF細胞以1×105個/孔密度接種于96孔板上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入5－FU使其終濃度為50、100、200、400、800μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)時間終止后，采用MTT法測定細胞存活率［13］，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，溫育4h，去除培養(yǎng)液及MTT，每孔加入150μL二甲基亞砜，用酶標儀測定各孔在波長490nm處吸光度。單細胞凝膠電泳法測定HSF細胞DNA損傷。

細胞存活率(%)=(正常組OD值－5－FU組OD值)/正常組OD值×100

1.2.3 實驗分組及給藥 實驗分為5組，分別為正常對照組、5－FU模型組、泰和烏骨雞活性肽低、中、高劑量組。泰和烏骨雞活性肽組加入濃度為10、50、250μg/mL泰和烏骨雞活性肽。正常對照組、5－FU模型組加入等量培養(yǎng)液;于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，泰和烏骨雞活性肽組和5－FU模型組加入終濃度為100μg/mL 5－FU，正常對照組加入等量的培養(yǎng)液。

1.2.4 MTT法測定HSF細胞存活率 取同代的對數(shù)生長期HSF細胞以1×105個/孔密度接種于96孔板上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，按照1.2.3實驗分組及給藥處理。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24和48h后采用MTT法測定細胞存活率。

1.2.5 單細胞凝膠電泳法檢測細胞DNA損傷

1.2.5.1 細胞處理及細胞懸液的制備 取同代的對數(shù)生長期HSF細胞以1×105個/孔接種于6孔板上，按1.2.3實驗分組及給藥處理。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，去除培養(yǎng)液，4℃ PBS洗一次，加入0.25%胰蛋白酶和 0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)消化3min，1000r/min離心5min后收集細胞，用PBS重懸，密度為1×105個/mL。

1.2.5.2 制片 單細胞凝膠電泳方法采用Singh等的方法［14］稍加改進后進行。將加熱溶解的0.75%正常熔點瓊脂糖冷卻至45～60℃時，取120μL鋪于載玻片上，4℃凝固10min。取25μL單細胞懸液與37℃3倍體積0.75%的低熔點瓊脂糖混勻液，鋪于第二層膠上，4℃固定10min。

1.2.5.3 電泳 將膠板浸于4℃裂解液(含2.5mmol/mL NaCl，100μmol/mL EDTANa2，10μmol/mL Tris，pH10.0，臨用前加10%的DMSO，1%的TritonX－100)中裂解1.5h。取出載玻片用蒸餾水輕柔漂洗2次，以免瓊脂糖脫落，然后將膠板浸于4℃電泳緩沖液(1μmol/mL EDTANa2，300μmol/mL NaOH，pH13.0)解螺旋20min，電泳(25V，200mA)20min。

1.2.5.4 中和及染色 電泳結束后，膠板用中和緩沖液(0.4mmol/mL Tris，pH7.5)中和三次，每次5min，中和完全后用2μg/mL的EB 50μL染色1min，蒸餾水脫色10min。以上操作均在4℃暗處進行。

1.2.5.5 結果觀察 熒光顯微鏡10×目鏡，20×物鏡下觀察結果(激發(fā)光波長510～560nm)及拍照。每組隨機選擇100個細胞計數(shù)，使用CASP軟件測量照片中尾長、尾矩、Olive尾矩等指標以反映細胞DNA的損傷程度。按照Kamer I的方法［15］利用彗星尾長將DNA損傷分為四級:A型(胞核清楚，尾長不超過10μm)、B型(胞核清楚，尾長在10～30μm之間)、C型(胞核熒光強度低，尾長在30～40μm之間)和D型(胞核和慧尾不能區(qū)分，尾長超過40μm)。計算公式如下:

尾長=彗星頭的右邊界到彗星尾部末端的距離

尾距=尾長×尾部DNA百分比

Olive尾距=從頭光密度重心到尾光密度重心的距離×尾部DNA百分比。

1.2.6 羥脯氨酸含量的測定及膠原含量的計算 取處于對數(shù)生長期的HSF，制成細胞懸液，以1×10個/孔接種于12孔板。按1.2.3實驗分組及給藥處理，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作用終止時吸取上清液0.5mL測羥脯氨酸含量。具體操作按羥脯氨酸檢測試劑盒說明書進行，測定上清液中羥脯氨酸在550nm處的吸光值(A值)，并根據(jù)公式計算羥脯氨酸含量，間接反映HSF細胞膠原含量。計算公式如下:5

表1 5－FU對HSF細胞DNA損傷的作用(±S，n=100)Table 1 Effect of 5－FU on DNA damage in HSF(±S，n=100)

表1 5－FU對HSF細胞DNA損傷的作用(±S，n=100)Table 1 Effect of 5－FU on DNA damage in HSF(±S，n=100)

注:與正常對照組相比，＊＊＊p＜0.001。

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1) 彗星率(%) 尾部DNA含量(%)尾長(μm) 尾距 Olive 尾距正常對照組 / 4.00 0.77±8.46 3.58±2.20 0.047±0.10 0.17±0.27 5－FU組 50 58.50 6.19±5.76＊＊＊ 12.98±9.74＊＊＊ 1.34±2.02＊＊＊ 1.58±1.61＊＊＊5－FU組 100 98.09 27.13±1.10＊＊＊ 34.78±11.01＊＊＊ 10.11±5.07＊＊＊ 8.31±2.80＊＊＊5－FU組 200 100.00 35.27±14.14＊＊＊ 51.18±15.25＊＊＊ 19.89±12.75＊＊＊ 12.78±6.10＊＊＊

表2 泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導HSF細胞增殖抑制的影響(±S，n=6)Table 2 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of proliferation in HSF(±S，n=6)

表2 泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導HSF細胞增殖抑制的影響(±S，n=6)Table 2 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of proliferation in HSF(±S，n=6)

注:與正常對照組相比，*p＜0.05，＊＊＊p＜0.001;與5－FU損傷組相比，ap＜0.05，bp＜0.001;表3～表4同。

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1) 24h存活率(%) 48h存活率(%) 100±3.73 100±1.49 5－FU損傷組 100 85.46±3.81＊＊＊ 51.18±0.81＊＊＊泰和烏骨雞活性肽組 10 91.40±2.49b 67.95±2.19c泰和烏骨雞活性肽組 50 94.06±2.84c 71.95±2.63c泰和烏骨雞活性肽組 250 99.77±3.74c 74.79±3.82正常對照組/ c

式中:A0為空白管吸光度;A1為標準管吸光度; A2為測定管吸光度。

1.2.7 統(tǒng)計分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行組間t檢驗。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同濃度5-FU對HSF細胞存活率的影響

如圖1所示，不同濃度的5－FU作用于HSF細胞24h后，隨著作用濃度增加細胞存活率與正常對照組相比顯著降低。濃度50、100μg/mL作用細胞存活率與正常對照組有顯著變化(p＜0.01)，但細胞存活率都在80%以上，濃度為大于等于200μg/mL 5－FU已出現(xiàn)明顯的細胞毒性，細胞存活率為小于75%。由于單細胞凝膠電泳要求細胞存活率應在80%以上，因此選用濃度50、100、200μg/mL的5－FU篩選單細胞凝膠電泳最適作用濃度。

2.2 不同濃度5-FU對HSF細胞DNA損傷作用

如表1所示，不同濃度的5－FU作用HSF細胞24h后，與正常組比較，5－FU的各劑量組均可導致HSF細胞DNA出現(xiàn)不同程度的損傷，隨著5－FU質(zhì)量濃度增大，彗星率、尾長、尾距、Olive尾距和尾部DNA含量顯著增加(p＜0.001)。50μg/mL實驗組對HSF細胞彗星率只有58.50%，屬于B型損傷，該損失比較輕微不適合作為單細胞凝膠電泳模型作用濃度。100μg/mL實驗組對 HSF細胞彗星率為98.09%，屬于C型損傷。200μg/mL實驗組對HSF細胞彗星率100%，且為D型損傷，對細胞的損傷非常嚴重，凋亡細胞比較多。故采用 100μg/mL的5－FU作為HSF細胞損傷模型。

圖1 5－FU對HSF細胞存活率的影響(±S，n=6)Fig.1 Effect of 5－FU on HSF survival(±S，n=6)

2.3 泰和烏骨雞活性肽對5-FU抑制HSF細胞增殖影響

如表2所示，泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導HSF存活率降低具有保護作用。與對照組比較，5－FU組可顯著性抑制HSF細胞的增長(p＜0.001)，與5－FU組比較，泰和烏骨雞活性肽組細胞存活率具有顯著性差異(p＜0.05)，且當5－FU作用48h時泰和烏骨雞活性肽組與5－FU組相比具有極顯著性差異(p＜0.001)，表明泰和烏骨雞活性肽能抑制5－FU誘導的HSF存活率下降。

2.4 泰和烏骨雞活性肽對5-FU所致HSF細胞DNA損傷保護作用

如表3所示，不同濃度的泰和烏骨雞活性肽均能顯著降低5－FU對HSF細胞DNA損傷作用，其中在10～250μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著泰和烏骨雞活性肽濃度的增加，抗損傷作用加強，泰和烏骨雞活性肽組細胞的彗星率、尾長、尾距、Olive尾距和尾部DNA含量與5－FU組相比具有顯著性差異(p＜0.001)。與空白對照組相比，250μg/mL泰和烏骨雞活性肽作用組沒有顯著性差異，表明該濃度下，泰和烏骨雞活性肽可完全對抗5－FU誘導的DNA損傷。

表3 泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導HSF細胞DNA損傷的保護作用(±S，n=100)Table 3 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced DNA damage in HSF(±S，n=100)

表3 泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導HSF細胞DNA損傷的保護作用(±S，n=100)Table 3 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced DNA damage in HSF(±S，n=100)

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1)彗星率(%)尾部DNA含量(%)尾長(μm) 尾距 Olive 27 5－FU損傷組 100 98.09 27.13±1.11＊＊＊ 34.78±11.01＊＊＊ 10.11±5.07＊＊＊ 8.31±2.80＊＊泰和烏骨雞活性肽組 10 61.50 9.43±7.76c 18.00±11.50c 2.52±2.91c 2.57±2.26c泰和烏骨雞活性肽組 50 30.70 4.47±4.63c 9.69±8.96c 0.79±1.37c 1.08±1.22c泰和烏骨雞活性肽組 250 4.00 0.92±2.09c 3.49±1.70c 0.06±0.21c 0.18±0.43尾距正常對照組 / 4.00 0.77±8.46 3.85±2.20 0.05±0.10 0.17±0.c

表4 泰和烏骨雞活性肽對5－FU抑制HSF細胞合成羥脯氨酸和膠原含量的保護作用(±S，n=3)Table 4 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of hydroxyproline and collagen synthesis in HSF(±S，n=3)

表4 泰和烏骨雞活性肽對5－FU抑制HSF細胞合成羥脯氨酸和膠原含量的保護作用(±S，n=3)Table 4 Protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced inhibition of hydroxyproline and collagen synthesis in HSF(±S，n=3)

組別 藥物質(zhì)量濃度(μg·mL－1) 羥脯氨酸含量(μg·mL－1) 膠原含量(μg·mL－1) 2.93±0.128 21.89±0.95 5－FU損傷組 100 2.55±0.128* 19.04±0.95*泰和烏骨雞活性肽 10 3.06±0.128b 22.85±0.95b泰和烏骨雞活性肽 50 3.57±0.26b 26.65±1.9b泰和烏骨雞活性肽 250 3.70±0.38b 27.6043±2.86正常對照組/ b

制備好的凝膠片在熒光顯微鏡下觀察時，可見DNA被EB染成紅色，未發(fā)生DNA斷裂的細胞表現(xiàn)為一圓形類核，即彗星頭部，熒光強度均勻，邊緣整齊(圖2(a))，正常組未受5－FU損傷的HSF細胞成圓形亮團;而發(fā)生DNA斷裂的細胞則表現(xiàn)為斷片向陽極方向遷移，形成彗星樣的拖尾(圖2(b))，5－FU組的HSF細胞在5－FU作用下，DNA分子受損嚴重，呈明顯的彗星樣變化。而預先應用250μg/mL泰和烏骨雞活性肽處理后的高劑量實驗組的HSF細胞DNA分子完整，影像與正常對照組相似。應用10、50μg/mL的泰和烏骨雞活性肽的低、中劑量組的HSF細胞雖仍有彗星樣的形態(tài)，但其尾跡也較5－FU組短且呈現(xiàn)一定的量效關系。

圖2 泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導HSF細胞DNA損傷保護作用的彗星圖形(×200)Fig.2 Comet picture of the protective effect of bioactive peptides from TBSF on 5－FU－induced DNA damage in HSF(×200)

2.5 泰和烏骨雞活性肽對5-FU誘導HSF細胞合成羥脯氨酸和膠原的影響

如表4所示，與正常組相比，5－FU損傷組可以顯著抑制羥脯氨酸的合成(p＜0.05)，不同濃度的泰和烏骨雞活性肽均能降低5－FU的抑制作用，與5－FU損傷組相比均可顯著增加HSF細胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量(p＜0.01)。表明泰和烏骨雞活性肽在10～250μg/mL濃度范圍內(nèi)可以促進HSF細胞分泌羥脯氨酸。

3 討論

目前直接或間接測定DNA損傷常用技術有單細胞凝膠電泳、環(huán)境誘變物短期篩選實驗(SOS/umu實驗)、微核實驗(MN)和姐妹染色體交換實驗(SCE)等［16］。單細胞凝膠電泳又稱為彗星實驗，是近年來發(fā)展起來的一種在單細胞水平上檢測真核細胞DNA損傷的方法［17］。該方法具有所需樣品量少，簡便，快速，無需放射性標記等優(yōu)點，廣泛地應用于DNA放射損傷、DNA剪切損傷、DNA交聯(lián)的檢測、藥物的毒性評價、細胞凋亡鑒定等工作中［18－20］。

盡管單細胞凝膠電泳已被應用20多年，但其檢測單個細胞DNA損傷的確切機理還不清楚，一般認為真核細胞的DNA分子量較大，DNA呈負超螺旋結構附著在核基質(zhì)上。當各種內(nèi)源性和外源性DNA損傷因子誘發(fā)細胞DNA鏈斷裂時，DNA的超螺旋結構受到破壞，在堿處理和堿性電解質(zhì)的作用下，DNA發(fā)生解螺旋，損傷的DNA斷鏈及片段被釋放出來，由于這些DNA的分子量很小，所以在電泳過程中會離開核DNA向陽極移動，因而形成了彗星的尾部，而較大的一些碎段位置則靠近細胞核，因而形成彗星的頭部。而未損傷的細胞，其核DNA仍停留在核基質(zhì)中，經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團，無拖尾現(xiàn)象。在一定條件下，彗星尾長和DNA含量分布與DNA損傷程度呈線性相關，因此尾矩被作為SCGE定量分析的主要依據(jù)［21］。本研究以HSF細胞為實驗對象，以5－FU作為DNA攻擊劑，造成HSF細胞DNA損傷。從表3和圖2可以看出，正常對照組細胞成圓形，沒有拖尾現(xiàn)象，5－FU組細胞呈現(xiàn)明顯的彗星樣，而泰和烏骨雞活性肽預處理組隨著藥物濃度的增加，出現(xiàn)彗尾的細胞數(shù)越來越少，細胞彗尾越來越短，直至沒有。提示泰和烏骨雞活性肽對5－FU造成的HSF細胞損傷有一定的保護作用。

膠原是真皮細胞間質(zhì)中的主要有形成分，由人皮膚成纖維細胞產(chǎn)生，對維持皮膚厚度、張力、緩沖外界創(chuàng)傷有重要作用。羥脯氨酸在膠原蛋白中具有高度特異性且含量穩(wěn)定，其含量約為膠原蛋白的13.4%，在彈力纖維中含量甚微，而其它蛋白中不存在，因此羥脯氨酸的含量可大致反映膠原蛋白的含量。本研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組HSF細胞比較，5－FU組HSF細胞增殖能力明顯減退，膠原合成能力降低。泰和烏骨雞活性肽在10～250μg/mL濃度范圍內(nèi)可促進HSF細胞增殖，增加膠原的合成，且在該劑量范圍內(nèi)呈量效關系。因此推測泰和烏骨雞活性肽對HSF膠原合成影響的原因為:a.通過改變HSF的數(shù)量，促進HSF增殖從而提高膠原的合成。b.泰和烏骨雞活性肽改變了HSF細胞某些生物學特性，提高了單個HSF細胞的膠原合成能力。

本文研究結果表明5－FU可顯著性抑制HSF細胞的增殖，造成HSF細胞DNA的損傷。然而在5－FU作用體系中加入泰和烏骨雞活性肽后，MTT法對細胞存活率的測定表明泰和烏骨雞活性肽對5－FU誘導HSF細胞增殖抑制具有顯著的保護作用，單細胞凝膠電泳結果顯示泰和烏骨雞活性肽組細胞彗星尾長、尾矩、Olive尾距和尾部DNA百分含量與5－FU組比較明顯減少，泰和烏骨雞活性肽可以有效地減少5－FU引起的HSF細胞DNA的斷裂損傷和提高HSF細胞分泌膠原蛋白的能力。綜上所述，體外實驗表明泰和烏骨雞活性肽可以有效對抗細胞DNA損傷，其作用機理還有待于進一步的研究。

［1］LONGLEY DB，HARKIN DP，JOHNSTON PG.5－flurouracil: mechanisms of action and clinical strategies［J］.Nature Review Canner，2003(3):330－338.

［2］FERGUSON MK.The effect of antineoplastic agents on wound healing［J］.Surgery，Gynecology＆Obstetrics，1982，154(3): 421－429.

［3］SHAPIRO MS，THOFT RA，F(xiàn)RIEND J，et al.5－Fluorouracil Toxicity to the Ocular Surface Epithelium［J］.Investigative Ophthalmology＆Visual Science，1985，26(4):580－583.

［4］MOHAY J，MCLAUGHIN BJ.Corneal endothelial wound repair in normal and mitotically inhibited cultures［J］.Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol，1995，233(11):727－736.

［5］YILDIZKH，GEZEN F，ISM，etal.MitomycinC，5－fluorouracil，and cyclosporine A prevent epidural fibrosis in an experimental laminectomy model［J］.European Spine Journal，2007，16(9):1525－1530.

［6］張松巖，曲宏巖.生長激素對術后早期腹腔化療下結腸吻合口愈合的影響［J］.哈爾濱醫(yī)科大學學報，2008，42(3): 271－273.

［7］張松巖，徐海濤，肖敏，等.谷氨酰胺對術后早期腹腔化療的結腸吻合口愈合的影響［J］.實用腫瘤學雜志，2009，23(3): 235－237.

［8］田穎剛，謝明勇，王維亞，等.烏骨雞雞肉中肌肽的鑒定與測定［J］.分析實驗室，2007，26(1):1－8.

［9］吳光杰，田穎剛，謝明勇，等.烏骨雞活性肽對體外非酶糖基化的抑制作用［J］.南昌大學學報:理科版，2007，31 (5):456－45.

［10］林霖，田穎剛，謝明勇，等.烏骨雞活性肽組成成分及體外抗氧化活性研究［J］.食品科學，2007，28(10):41－45.

［11］王勇，劉建華，田穎剛，等.謝明勇泰和烏骨雞活性肽補血作用研究［J］.食品科學，2010(21):340－343.

［12］田穎剛.一種用于化療減毒增效的烏骨雞肽的制備方法及其應用［P］.中國專利:201210097950.1，2012－04－09.

［13］司徒鎮(zhèn)強，吳軍正.細胞培養(yǎng)［M］.西安:世界圖書出版公司，2004:250－252.

［14］朱文文，王曉濤.DNA損傷檢測－單細胞凝膠電泳技術的研究［J］.微量元素與健康研究，2007，24(3):6－7.

［15］KAMER I，RINKEVICH B.In vitro application of the comet assay for aquatic genotoxicity:considering a primary culture versus a cell line［J］.Toxicol In Virto，2002，16(2):177－184.

［16］馬愛國，臧金林，宋風榮，等.SCGE，SCE和染色體畸變分析法用于DNA損傷與修復檢測的對比研究［J］.癌變.畸變.突變，2001，13(3):155－157.

［17］OLIVE PL，WLODEK D，BANáTH JP.DNA double－strand breaks measured in individual cells subjected to gelelectrophoresis［J］.Cancer Res，1991，51(17):467l－4676.

［18］OLIVE PL.Impat of the comet assay in radiobillogy［J］.Mutat RES，2009，681(1):13－23.

［19］MCKENNA DJ，MCKEOWN SR，MCKELVEY－MARTN VJ.Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer［J］.Mutagenesis，2008，23(3):183－190.

［20］薛同敏，郭忠.單細胞凝膠電泳技術應用進展［J］.西北民族大學學報，2011，32(3):70－73.

［21］COLLINS AR，OSCOZ AA，BRUNBORG G，et al.The comet assay:topical issues［J］.Mutagenesis，2008，23(3):143－151.

Protective effect of bioactive peptides from taihe black－bone silky fowls on human skin fibroblasts injured by 5－fluorouracil

TIAN Ying－gang1，WANG Chun－yan1，HUANG Yu－mei2，LIAO Chun－yan1，ZHANG Pan1，ZHU Sheng1，QIAO Juan－juan1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China;
2.College of Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330029，China)

Objective:A DNA injury model was established by using 5－fluorouracil(5－FU)in this study.Methods:A series of experiments(MTT assay，single cell gel electrophoresis(SCGE)，and hydroxyproline assay kits)were designed to investigate the effect of bioactive peptides from Taihe Black－Bone Silky Fowl(TBSF)on Human Skin Fibroblasts(HSF)against 5－FU－induced DNA damage.Cultured HSF were randomly divided into three groups:the control group，5－fluorouracil group and 5－fluorouracil+bioactive peptides from TBSF.Cell viability was measured by MTT assay，DNA damage was detected by SCGE assay，and hydroxyproline levels in HSF culture medium were measured by hydroxyproline assay kits.Results:compared with the control group，5－FU group exacerbated the DNA damage，in which the tail length，the tail moment，the Olive tail moment，and the tail DNA content significantly increased(p＜0.001)，whereas the content of hydroxyproline in HSF culture medium significantly decreased(p＜0.05).Compared with 5－FU group，Bioactive peptides from TBSF attenuated 5－FU－induced DNA damage，in which the tail length，the tail moment，the Olive tail moment and the tail DNA content significantly decreased(p＜0.05)，whereas the content of hydroxyproline increased dramatically(p＜0.01).Conclusion:Bioactive peptides from TBSF can protect HSF against 5－FU－induced DNA damage in a dose－dependent manner.

black－bone silky fowl;bioactive peptides;5－fluorouracil;DNA damage;single cell gel electrophoresis

TS201.4

A

1002－0306(2012)21－0356－05

2012－04－23

田穎剛(1972－)，男，博士，副研究員，研究方向:食品化學與營養(yǎng)。

江西省青年科學家培養(yǎng)計劃(2010)資助項目(贛科發(fā)計字［2010］209號)。