王淑華，林永強(qiáng)，徐麗華

(1.山東省生物藥物研究院，山東濟(jì)南250101;2.山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250101)

燙傷油是根據(jù)中醫(yī)臨床驗(yàn)方研制，由馬尾連、紫草、黃芩、地榆、大黃和冰片(合成龍腦)6味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒，涼血祛腐止痛的功效。1970年批準(zhǔn)生產(chǎn)，后陸續(xù)收載于《山東省藥品標(biāo)準(zhǔn)》1986年版［1］和《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)—中藥成方制劑(第二冊(cè))》，標(biāo)準(zhǔn)僅有制法、性狀和異物檢查項(xiàng)［2］。可控項(xiàng)目較少，為確保制劑質(zhì)量，對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了系統(tǒng)全面的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 6890氣相色譜儀;Sartorius CP225D電子天平。

1.2 試藥 對(duì)照品及對(duì)照藥材均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)分別為:紫草:110736－200525;黃芩素:111595－200905;大黃素甲醚:110758－200611;大黃酚:110796－200716;冰片:110743－200504;水楊酸甲酯:707－200107。樣品:3家生產(chǎn)企業(yè)的10批燙傷油批號(hào)見(jiàn)表2。氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷和乙酸乙酯等均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

本品輔料為麻油，按傳統(tǒng)方法用甲醇、乙醇、三氯甲烷等溶劑提取時(shí)，均會(huì)溶解大量的麻油，很難去除，影響了薄層效果。由于紫草的主要成分為萘醌類化合物，黃芩所含的主要成分黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等均為黃酮類化合物，大黃所含的大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等均為蒽醌類化合物，這三類化合物均有一共同的特點(diǎn):含多個(gè)酚羥基，具一定的酸性。因此可用酸堿處理的方法同時(shí)從燙傷油中提取紫草、黃芩和大黃三種藥材的多酚羥基成分，再用三氯甲烷提取酸性水溶液，即可得到供試品溶液。

2.1 紫草的薄層色譜鑒別 取本品20 g，用2%氫氧化鈉溶液20 mL振搖提取，提取液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至酸性，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。取紫草對(duì)照藥材0.5 g，用麻油13 g浸泡24 h后炸至枯黃，濾過(guò)，同供試品溶液的制備方法制成對(duì)照藥材溶液。同時(shí)取處方中除去紫草的其他藥味，按處方比例制成陰性對(duì)照樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。氨蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 紫草鑒別的薄層色譜圖

2.2 黃芩的薄層色譜鑒別 黃芩所含的黃酮類主要化合物黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等均為多酚羥基化合物，顯酸性，故采用紫草鑒別中的供試品溶液。取黃芩素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。同時(shí)取處方中除去黃芩的其他藥味，按處方比例制成缺黃芩的陰性對(duì)照樣品。取陰性對(duì)照樣品約20 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(10∶3∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以 5% 三氯化鐵乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.3 大黃的薄層色譜鑒別 大黃所含大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等均為酚羥基蒽醌衍生物，顯酸性，故也可采用紫草鑒別中的供試品溶液。取大黃素甲醚和大黃酚對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL各含0.5mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。同時(shí)取處方中除去大黃的其他藥味，按處方比例制成缺大黃的陰性對(duì)照樣品。取陰性對(duì)照樣品約20 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。置氨蒸氣中熏至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖2 黃芩鑒別的薄層色譜圖

圖3 大黃鑒別的薄層色譜圖

3 含量測(cè)定

處方中的馬尾連、大黃、紫草、地榆、黃芩均使用油炸提取，常用的指標(biāo)成分大黃素、左旋紫草素和黃芩苷等已發(fā)生部分轉(zhuǎn)化［3］，因此選擇處方中具有清熱止痛作用的冰片為含量測(cè)定指標(biāo)，用水楊酸甲酯為內(nèi)標(biāo)的毛細(xì)管氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。

3.1 色譜條件 彈性石英毛細(xì)管柱(柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度 0.25 μm)HP －FFAP;程序升溫:初始溫度 130℃，保持15 min，以每分鐘30℃的速率升溫至200℃，保持5 min;檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，檢測(cè)器溫度為300℃;進(jìn)樣口溫度為210℃;恒壓11.47 PSi;分流比10∶1;進(jìn)樣量 1 μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取冰片對(duì)照品20.36 mg，加乙酸乙酯溶解并稀釋至50 mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(濃度為:0.407 2 mg·mL－1)。精密稱取水楊酸甲酯 86.18 mg，加乙酸乙酯稀釋至100 mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液(濃度為:0.861 8 mg·mL－1)。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品0.5 g，置10 mL量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.4 線性范圍 分別精密吸取3.2項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置 10 mL 量瓶中，分別加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，各精密吸取1 μL，注入氣相色譜儀測(cè)定。以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，異龍腦和龍腦的峰面積之和為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 680.044 2 X+12.219 6，相關(guān)系數(shù) r=0.999 5。結(jié)果表明，冰片進(jìn)樣量在0.081 44～0.407 2 μg之間與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

3.5 儀器精密度試驗(yàn) 取3.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液按確定的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以冰片中龍腦和異龍腦的總面積計(jì)算平均校正因子及RSD，計(jì)算公式:校正因子(AS:內(nèi)標(biāo)物峰面積;CS:內(nèi)標(biāo)物濃度;AR:對(duì)照品峰面積;CR:對(duì)照品濃度)結(jié)果平均校正因子 f值為0.684 6，RSD為0.29%。結(jié)果表明本方法精密性良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣一次，每次1 μL，共考察8 h，測(cè)定各異龍腦與龍腦的峰面積之和與水楊酸甲酯峰面積的比值，以觀察樣品溶液在檢測(cè)過(guò)程中待測(cè)成分的穩(wěn)定性。結(jié)果表明供試液在8 h內(nèi)異龍腦與龍腦的峰面積之和與水楊酸甲酯峰面積的比值RSD為0.69%，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取燙傷油(廣西 批號(hào)080304)按照供試品溶液的制備方法，平行制備6份樣品，按上述方法和條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每份供試品的含量。結(jié)果平均含量為3.2 mg·g－1，RSD為1.2%，說(shuō)明本品含量測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

3.8 加樣回收率 精密稱取已知含量為3.2 mg·g－1的樣品(廣西 批號(hào)080304)0.25 g，共6份，每份分別加入濃度為0.412 8 mg·mL－1的冰片對(duì)照品溶液2 mL，內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，加乙酸乙酯使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，吸取1 μL，注入氣相色譜儀，分別計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1，表明測(cè)定方法的回收率良好。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.9 空白試驗(yàn) 取處方中除去冰片的其他藥味，按處方比例制成缺冰片的陰性對(duì)照樣品。取陰性對(duì)照樣品約0.5 g，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

分別精密吸取上述內(nèi)標(biāo)溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)水楊酸甲酯保留時(shí)間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中無(wú)相應(yīng)色譜峰。說(shuō)明處方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

圖4 空白試驗(yàn)GC色譜圖

3.10 樣品測(cè)定 按本文建立的方法分別測(cè)定了三家企業(yè)10批樣品的含量(n=2)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批樣品中冰片含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 薄層鑒別制備供試品溶液時(shí)，曾采用乙醇萃取法［4］。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)乙醇萃取液濃縮后仍有大量麻油，無(wú)法進(jìn)一步精制，提取特征成分。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)紫草、黃芩和大黃所含的特征成分均為多酚羥基化合物，具一定的酸性。因此采用酸堿水溶液處理方法既能很好地從麻油中提取特征成分，又能同時(shí)提取紫草、黃芩和大黃三味藥材中的多酚羥基成分，實(shí)現(xiàn)一個(gè)供試品溶液供多味藥材鑒別的目的，為同類劑型的質(zhì)量分析提供參考。

4.2 紫草的薄層色譜鑒別方法建立時(shí)曾嘗試以紫草對(duì)照藥材和左旋紫草素對(duì)照品為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，未見(jiàn)相同顏色的斑點(diǎn)。由于制備工藝中經(jīng)過(guò)油炸工序，紫草所含的萘醌類化合物可能轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。故將紫草對(duì)照藥材同樣通過(guò)油炸后，提取制備對(duì)照藥材溶液，結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。黃芩的薄層色譜鑒別方法曾嘗試以黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素為對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果供試品色譜中未檢出黃芩苷，可能是黃芩苷遇高溫被破壞，檢出黃芩素和漢黃芩素，但漢黃芩素斑點(diǎn)不清晰，故最終選擇黃芩素作對(duì)照。

4.3 本試驗(yàn)還對(duì)燙傷油的色譜條件進(jìn)行了最優(yōu)條件的選擇，考察了不同的色譜柱:Agilent HP－FFAP、Agilent Innowax和Agilent DB－1701，結(jié)果三種色譜柱測(cè)定冰片，對(duì)稱因子、分離度和理論板數(shù)等均符合要求［5］，選擇該色譜條件測(cè)定冰片，對(duì)色譜柱選擇性不強(qiáng)，適用范圍廣。還比較了不同的柱溫:110℃恒溫測(cè)定，各成分峰都達(dá)到較好的分離，但由于保留時(shí)間較長(zhǎng)，影響峰形;150℃恒溫測(cè)定，異龍腦和龍腦的分離度達(dá)不到要求;130℃恒溫測(cè)定，各成分峰都達(dá)到較好的分離，且峰形較好，但供試品色譜中，待測(cè)成分檢出后，仍有雜質(zhì)峰出現(xiàn)。為了避免雜質(zhì)峰影響及節(jié)約分析時(shí)間，最終選擇3.1項(xiàng)下的色譜條件。由表2測(cè)定結(jié)果可以看出，三家企業(yè)十批樣品的含量從1.2到6.1 mg·g－1，差異達(dá)5倍。說(shuō)明由于原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)冰片進(jìn)行質(zhì)量控制，企業(yè)產(chǎn)品批間均一性較差。因此，通過(guò)對(duì)燙傷油中冰片質(zhì)量分析方法的建立，可有效控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

［1］山東省衛(wèi)生廳.山東省藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.濟(jì)南:山東省衛(wèi)生廳，1986.

［2］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑(第二冊(cè))［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1990.

［3］葉勇，潘渭樵.溫度對(duì)紫草素及其衍生物穩(wěn)定性的影響［J］.中國(guó)藥物與臨床，2007，7(7):540 －541.

［4］陳晶，馬學(xué)禮，何艷萍.復(fù)方紫草油質(zhì)量控制方法的研究［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志2007，29(12):1147.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄38.