龍星宇，陳福南

（西南大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，重慶 400715)

高效液相色譜-Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2化學(xué)發(fā)光體系檢測啤酒中的亞硫酸鈉

龍星宇，陳福南*

（西南大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，重慶 400715)

在酸性條件下，Ce（SO4）2氧化Ru（bipy）32+時，在Na2SO3存在下，對該化學(xué)發(fā)光具有很強(qiáng)的增敏作用，據(jù)此建立通過HPLC分離、用化學(xué)發(fā)光檢測器測定亞硫酸鈉的方法。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，測定亞硫酸鈉的線性范圍為2.0×10-6～ 5.0×10-4g/mL，方法的檢出限為6.0×10-7g/mL，定量下限為2.0×10-6g/mL，線性回歸方程：ΔI=3.578c+19.721（c：g/mL；r2=0.9984），對5.0×10-5g/mL亞硫酸鈉進(jìn)行了11次平行測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%。該法已成功的運(yùn)用于實(shí)際啤酒樣中亞硫酸鈉的含量。

高效液相色譜，化學(xué)發(fā)光，釕聯(lián)吡啶，硫酸鈰，亞硫酸鈉

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水亞硫酸鈉 浙江省永嘉縣化工試劑廠，分析純，批號：國藥準(zhǔn)字100408；乙腈 色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；釕（Ⅱ）聯(lián)吡啶 Newburyport，USA；硫酸鈰 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：F20080303；水 超純水。

KromasilTMC18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）Dikma Technologies公司；高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光分析檢測系統(tǒng)如圖1所示；D-7000HPLC高效液相色譜儀，L-7100泵 Hitachi，Japan；微弱發(fā)光分析檢測儀MCFL-A，西安瑞邁；AGE微量進(jìn)樣器（50μL） 寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠；CQ-2200型超聲波清洗器 上海滬超超聲波儀器有限公司；UNIQUE-R10多功能超純水機(jī) 銳思捷；HL-2恒流泵 上海清浦滬西儀器廠。整個檢測分析過程中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和處理，均由Windows XP系統(tǒng)下D-7000 HSM軟件（Hitachi.Ltd. 1994-2001 Version 4.0）和BPLC軟件共同完成。

圖1 高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光法檢測系統(tǒng)示意圖Fig.1 HPLC-CL detection system

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 0.1mol/L硫酸鈰儲備液：準(zhǔn)備稱取4.0400g硫酸鈰，用0.05mol/L的H2SO4溶液溶解并定容至100mL的容量瓶中；實(shí)驗(yàn)條件中所用濃度，皆是用0.5mol/L硝酸稀釋至所需濃度。1.0×10-3g/mL釕聯(lián)吡啶儲備溶液：精確稱量0.1000g的釕（Ⅱ）聯(lián)吡啶用水定容至100mL的容量瓶中。1mg/mL亞硫酸鈉儲備液：稱量亞硫酸鈉約0.1g左右，溶解于流動相中，超聲溶解5min，定容至100mL的容量瓶中，并用碘量法標(biāo)定后使用。并于當(dāng)天臨用時現(xiàn)配。以上試劑使用時逐級稀釋。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)條件 KromasilTMC18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）。流動相：乙腈-水（40∶60，v/v），在使用前經(jīng)0.22μm濾膜抽濾超聲脫氣（15min）處理；流速：0.8mL/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫；壓強(qiáng)：大氣壓。

1.2.3 操作方法 按圖1將裝置安裝好進(jìn)行操作，儀器預(yù)熱20min，設(shè)置好儀器參數(shù)，初始化儀器軟件。在使用高效液相色譜前，分別用超純蒸餾水及流動相充分沖洗柱子，待基線穩(wěn)定后，取用碘量法標(biāo)定好的亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液或啤酒樣品溶液20μL進(jìn)樣，記錄儀記錄化學(xué)反應(yīng)的發(fā)光信號，以相對峰高定量（三次求平均）。

1.2.4 樣品處理 對市售四種不同品牌的啤酒樣液先經(jīng)0.22μm濾膜過濾，濾液密封保存在4℃冰箱中待用，保存時間不超過2d。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光條件

2.1.1 介質(zhì)酸的選擇 分別考察了H3PO4、HCl、HNO3、H2SO4四種酸介質(zhì)，對此化學(xué)發(fā)光體系的影響。提供酸性環(huán)境，使氧化劑Ce（Ⅳ）處于活性氧化劑狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HNO3作為介質(zhì)時，可使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，這可能是由于HNO3本身具有較強(qiáng)的氧化性[12]。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇HNO3為酸性介質(zhì)。

2.1.2 介質(zhì)酸HNO3的濃度 在酸性環(huán)境當(dāng)中，氧化劑的氧化能力顯著增強(qiáng)。我們考察了HNO3在0.2～ 2.0mol/L范圍內(nèi)，該發(fā)光體系化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度。在此濃度范圍內(nèi)，隨著酸的濃度增加，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯減小，之后變化不大趨于平穩(wěn)（如圖2所示），這可能是由于溶解氧化劑硫酸鈰時所用的0.5mol/L硫酸，足以保證氧化劑以足夠多的活性氧化態(tài)形式存在。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇HNO3的最佳濃度為0.5mol/L。

圖2 硝酸濃度的影響Fig.2 Effect of HNO3concentration

2.1.3 Ru（bipy）32+的濃度 Ru（bipy）32+作為發(fā)光試劑，其濃度對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度起著非常重要的作用。在選定的介質(zhì)硝酸及其濃度的前提下，固定其它條件不變，研究Ru（bipy）32+的濃度在2.0×10-5～5.0×10-4g/mL范圍內(nèi)化學(xué)發(fā)光體系的相對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)表明，隨著發(fā)光試劑濃度的不斷增加，ΔI值不斷增大，但當(dāng)其濃度超過8.0×10-5g/mL時，盡管發(fā)光信號增大，但背景值也隨之升高，即ΔI值減少。綜合考慮發(fā)光強(qiáng)度與背景值各自因素的影響，最終選取8.0×10-5g/mL作為Ru（bipy）32+的最佳濃度（見圖3）。

圖3 釕聯(lián)吡啶濃度的影響Fig.3 Effect of Ru（bipy）32+concentration

2.1.4 Ce（SO4）2的濃度 Ce（SO4）2作為氧化劑，在該化學(xué)發(fā)光體系中的作用不可忽視。固定其它條件不變，分析了Ce（SO4）2在4.0×10-4～1.5×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)的發(fā)光信號。如圖4中，當(dāng)Ce（Ⅳ）濃度過小時，體系不能提供足量的氧化劑，不能使發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，只要滿足體系當(dāng)中存在足量的氧化劑即可。則本實(shí)驗(yàn)選擇Ce（SO4）2的最佳濃度為8.0×10-4mol/L。

圖4 硫酸鈰濃度的影響Fig.4 Effect of Ce（SO4）2concentration

2.1.5 恒流泵流速 在流動注射化學(xué)發(fā)光分析中，反應(yīng)載體的流速是影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的一個重要因素。流速過慢會導(dǎo)致發(fā)光在流通池之前；同樣若流速過快會導(dǎo)致發(fā)光在流通池之后，不適宜的流速都可能導(dǎo)致在流通池中檢測不到最大發(fā)光信號。本文在固定流動相流速（1mL/min）及其它條件不變的情況下，考察了不同流速對化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，隨著流速的增大，發(fā)光信號增大，增大到一定程度后，發(fā)光信號逐漸降低，兼顧靈敏度和分離度的要求，反應(yīng)試劑流速選擇為1.45mL/min。

2.2 色譜分離條件

2.2.1 流動相 一般常用作流動相中的有機(jī)相為甲醇和乙腈。考察了甲醇-水、乙腈-水相同比例下，在該化學(xué)發(fā)光體系中二者之間的相對發(fā)光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種不同的流動相均可對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離，并都對發(fā)光體系有抑制，盡管甲醇-水對化學(xué)發(fā)光抑制要小，但其基線不穩(wěn)，易發(fā)生漂移；乙腈-水對化學(xué)發(fā)光的抑制較大，但其基線較平，背景值較小，峰形對稱。因此我們選擇乙腈-水作為色譜分離的流動相。進(jìn)一步考慮乙腈的體積分?jǐn)?shù)對化學(xué)發(fā)光信號的影響。實(shí)驗(yàn)表明，乙腈的體積分?jǐn)?shù)為30%～70%之間的流動相，都可以使亞硫酸鹽與其它成分得到很好地分離，保留時間相差不是很大。當(dāng)其為40%時可檢測到化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大，而乙腈體積分?jǐn)?shù)大于40%時，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度急劇下降。所以，我們選用乙腈∶水= 40∶60（v/v）的流動相。

2.2.2 高壓泵流速 我們探究了0.5～1.3mL/min范圍內(nèi)的高壓泵流速。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高壓泵流速快，保留時間短，但是分離不徹底。反之，若高壓泵流速慢，流動相與發(fā)光體系易形成高的背景值，而且峰形較寬，峰展寬較大。綜合考慮分離效果與信噪比，實(shí)驗(yàn)選擇高壓泵最佳流速為0.8mL/min。

2.3 校準(zhǔn)曲線、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和檢出限

在上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，亞硫酸鈉的濃度在2.0×10-6～5.0×10-4g/mL范圍內(nèi)與相對發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為ΔI=3.578c+19.721（c：g/mL）；r2=0.9984；根據(jù)IUPAC建議，按3倍空白信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，方法的檢出限為6.0×10-7g/mL。對5.0×10-5g/mL濃度的亞硫酸鈉平行測定11次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%。亞硫酸鈉的保留時間為2.15min。

2.4 樣品分析

一份準(zhǔn)確量取1mL濾液（1.2.4方法中已處理好的濾液）于10mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，根據(jù)圖1所示，進(jìn)行樣品測定；另一份準(zhǔn)確量取1mL濾液（1.2.4方法中已處理好的濾液）于小燒杯中，并加入1mL 1mol/L HNO3，置于超聲清洗儀中超聲處理5min驅(qū)趕二氧化硫氣體后，再轉(zhuǎn)入10mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按1.2.3進(jìn)行測定，兩份樣品溶液化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的差值即為亞硫酸根所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。圖5為所加入的HNO3對啤酒樣品處理的色譜圖及HNO3空白色譜圖。實(shí)驗(yàn)表明，酸化處理前后，亞硫酸鹽的特征保留時間處不受干擾可以用于定量分析，整個分析時間不超過400s。圖6為實(shí)測亞硫酸鈉和實(shí)際啤酒樣品的色譜分離圖。HPLCCL測定市售四種不同品牌的啤酒中所含亞硫酸鈉的結(jié)果見表1。

圖5 HNO3色譜圖Fig.5 HNO3Chromatogram

表1 HPLC-CL方法測定四種市售不同品牌啤酒中亞硫酸鈉的結(jié)果Table 1 Results of HPLC-CL method determination sodium sulfite in four kinds of beer sold in the city

圖6 色譜圖Fig.6 Chromatogram

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光聯(lián)用的方法檢測啤酒樣中的亞硫酸鈉，線性范圍為2.0×10-6～5.0× 10-4g/mL，最低檢測限為6.0×10-7g/mL，對5.0×10-5g/mL濃度的亞硫酸鈉平行測定11次，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7%，精密度較高；回收率在95.1%～103.9%之間，結(jié)果也表明，這四種啤酒中亞硫酸鈉的含量均沒有超標(biāo)。該方法應(yīng)用于食品中添加劑的測定，對樣品不需要進(jìn)行酒精的蒸餾，整個分析時間不超過400s，簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并成功應(yīng)用于啤酒中亞硫酸鈉的檢測。

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Determination of sodium sulfite in beer samples by high performance
liquid chromatography with Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2chemiluminescence detection

LONG Xing-yu，CHEN Fu-nan*
（School of Chemistry and Chemical Engineering of Southwest University，Chongqing 400715，China）

The CL radiation was emitted in the reaction of cerium sulfate oxidation reagent with tris （2，2-bipyridyl）ruthenium（Ⅱ）in the presence of acid.The existence of sodium sulfite made the reaction more sensitive

and strong.The optimal conditions for the CL detection were studied and a new method for determining sodium sulfite was described by HPLC-CL.The linear range was 2.0×10-6～5.0×10-4g/mL with the detection limit of 6.0×10-7g/mL，linear regression equation：△I=3.578c+19.721（c：g/mL；r2=0.9984），and the relative standard detection was 3.7%for 5.0×10-5g/mL.This method has obtained satisfactory results in the analysis of sodium sulfite in beer samples.

high-performance liquid chromatography；chemiluminescence；Ru（bipy）32+；Ce（SO4）2；sodium sulfite

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0320-04

亞硫酸鈉是一種重要的食品添加劑，在食品的各種處理過程和儲存環(huán)境中，能非常有效地阻止酶和非酶類物質(zhì)發(fā)生酶促反應(yīng)。同樣，它也可抑制食品中微生物所引起的酸化和酸敗[1-2]。但亞硫酸鹽能誘發(fā)部分人出現(xiàn)嚴(yán)重的哮喘[3-4]，而且在食品中添加過量的亞硫酸鹽也會使食品喪失原有的香味[5]，此外，亞硫酸鹽在體內(nèi)被氧化生成硫酸鹽，易刺激消化器官[6]。因此，我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760-2007）對各類食品中亞硫酸鹽的允許限量有明確規(guī)定。我國標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.34規(guī)定用鹽酸副玫瑰苯胺比色法來測定[7]，但由于在操作過程中使用劇毒溶液，對環(huán)境造成污染，對于復(fù)雜樣品的檢測結(jié)果不好，干擾因

2011－03－28 *通訊聯(lián)系人

龍星宇（1982-），男，碩士研究生，主要從事高效液相色譜和化學(xué)發(fā)光在食品方面的研究。

西南大學(xué)博士基金項(xiàng)目（2120040511）。素多，且檢測時間長?；瘜W(xué)發(fā)光分析法具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，加上高效液相色譜高效分離的特點(diǎn)，使HPLC-CL方法的聯(lián)用得以廣泛運(yùn)用[8-11]，成為一種有效的痕量及超痕量分析技術(shù)。三（2，2-聯(lián)吡啶）釕（Ⅱ）Ru（bipy）32+是一個靈敏的化學(xué)發(fā)光試劑，在酸性條件下，以Ce（SO4）2為氧化劑，Na2SO3可以成比例增強(qiáng)Ru（bipy）32+的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。據(jù)此，建立了以此化學(xué)發(fā)光體系測定亞硫酸鈉的分析方法，并以HPLC色譜分離，測定實(shí)際啤酒樣中亞硫酸鈉的含量。