劉志鵬，楊海麟，夏小樂，張 玲，王 武

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

果醋發(fā)酵液殘留乙醇含量的快速檢測

劉志鵬，楊海麟，夏小樂，張 玲，王 武*

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

在康維皿比色法的基礎(chǔ)上，建立了一種快速測定果醋發(fā)酵液殘留乙醇的新方法。結(jié)果表明:采用康維皿作為反應(yīng)容器，乙醇反應(yīng)體系在580nm處具有最大吸收峰。果醋中的乙醇濃度在0.5%～10%(v/v)之間呈良好線性，回歸方程為Y=0.07389X－0.00886，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。該方法具有取樣量少、快速、準(zhǔn)確、無需復(fù)雜儀器等優(yōu)點(diǎn)，不僅適于測定果酒或果醋終產(chǎn)品的乙醇含量，也便于跟蹤果酒或果醋生產(chǎn)過程的乙醇含量動態(tài)變化，具有較好的應(yīng)用推廣價(jià)值。

康維皿，快速檢測，殘留乙醇，果醋

發(fā)酵型果醋具有軟化血管、解酒保肝、調(diào)節(jié)體液循環(huán)和抗癌養(yǎng)生等功效，被譽(yù)為繼碳酸飲料、飲用水、果汁和茶飲料之后的“第四代”飲料，發(fā)展空間和市場潛力巨大［1－2］。發(fā)酵型果醋經(jīng)兩階段發(fā)酵而成，先經(jīng)酵母菌發(fā)酵為果酒，后由醋酸菌發(fā)酵成果醋。果醋發(fā)酵液含有果汁中殘留的糖類物質(zhì)和酵母菌、醋酸菌代謝生成的各類醇類、酚類和有機(jī)酸等物質(zhì)，增加了果醋殘留乙醇含量的檢測難度［3－5］。果醋發(fā)酵液中的乙醇含量是果醋釀造過程中的的重要監(jiān)測指標(biāo)，是醋酸發(fā)酵終止點(diǎn)的重要判斷依據(jù)，直接關(guān)系著發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量及相關(guān)發(fā)酵參數(shù)的計(jì)算，美國液態(tài)食醋標(biāo)準(zhǔn)(AOAC)規(guī)定果醋中殘留乙醇含量需小于0.5%(v/v)［6］。傳統(tǒng)的乙醇測定方法主要有三種:氣相色譜法、密度瓶法和乙醇計(jì)法。氣相色譜法精度高，用樣少，速度快，但氣相色譜儀比較昂貴，對操作者的要求以及儀器維護(hù)費(fèi)用都較高，不適用于中小企業(yè)應(yīng)用;密度瓶法和乙醇計(jì)法為避免溶液內(nèi)其他物質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾需先將發(fā)酵液經(jīng)過蒸餾等處理后再測定，步驟繁瑣，并且所用樣品量多且花費(fèi)時(shí)間較長，精密度和準(zhǔn)確度較差［7－9］，上述方法主要運(yùn)用在乙醇發(fā)酵檢測中，在果醋生產(chǎn)過程中仍欠缺一種快速靈敏的檢測方法?？稻S皿比色法測乙醇原理基于加熱的乙醇在康維皿封閉環(huán)境下從飽和K2CO3環(huán)境中逸出與K2Cr2O7在酸性條件下反應(yīng)生成綠色的Cr2(SO4)3，色澤在一定范圍內(nèi)與乙醇濃度成正比，通過測定吸光度可確定發(fā)酵液中的乙醇含量。該方法操作快捷簡便，樣品純度要求低，檢測成本低廉，能夠快速測定果醋發(fā)酵兩個(gè)階段的乙醇含量，但該方法目前沒有系統(tǒng)的使用規(guī)范，相關(guān)涉及文獻(xiàn)很少，并且在檢測液的配制和檢測過程上仍存在一定問題，如缺少精確的顯色液配比，沒有固定的檢測限，缺乏實(shí)際果醋發(fā)酵檢驗(yàn)等［10－11］。本工作針對以上問題在原有康維法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，通過精確計(jì)算確定了重鉻酸鉀和濃硫酸的添加量，按比例配制重鉻酸鉀－硫酸溶液，保證了顯色液內(nèi)反應(yīng)物質(zhì)的濃度，同時(shí)通過對果醋發(fā)酵全過程乙醇濃度的檢測驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確度和對果醋發(fā)酵過程的適應(yīng)性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安琪果酒活性干酵母 安琪公司;滬釀1.01醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus) 本實(shí)驗(yàn)室保藏;濃縮蘋果汁 無錫市橙汁源果汁廠;標(biāo)準(zhǔn)溶液110%(v/v)乙醇溶液;標(biāo)準(zhǔn)溶液2 0.5%～10%(v/v)乙醇溶液;飽和K2CO3溶液 無水K2CO3115g溶于100m L水中，用時(shí)取上清液;醋酸菌固體培養(yǎng)基 葡萄糖 10g/L、酵母粉 5g/L、瓊脂粉 20g/L、CaCO320g/L、pH6.5，121℃滅菌20m in冷卻至70℃加入無水乙醇4%，搖勻后分裝試管擺斜面;醋酸菌種子培養(yǎng)基 葡萄糖5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L、硫酸鎂0.5g/L、調(diào)pH6.5，121℃滅菌20m in;果醋發(fā)酵培養(yǎng)基 果酒發(fā)酵出乙醇含量為6%(v/v)左右的果酒;其他試劑 均為分析純，市售。

塑料康維皿 外徑90mm，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;LDZX－40Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;9162MBE型恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;HYL－A型全溫?fù)u床柜 太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;V－1100D型可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)有限公司;DHG－9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵方法［12］果酒發(fā)酵:濃縮蘋果汁稀釋至含糖量120g/L左右;活化后的酵母菌以4‰(v/v)接種量加入果酒發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25℃恒溫培養(yǎng)3～4d至含糖量降至5g/L時(shí)終止發(fā)酵。

果醋發(fā)酵:醋酸菌經(jīng)斜面和種子培養(yǎng)基活化后以10%(v/v)接種量加入發(fā)酵好的果酒中，于30℃，轉(zhuǎn)速170 r/m in恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)2～3d至乙醇濃度降至0.5g/L為發(fā)酵終點(diǎn)。

1.2.2 顯色液配比的推導(dǎo)及測定方法 液配比的推導(dǎo):設(shè)濃度為1%(v/v)的乙醇在康維皿中完全揮發(fā)并反應(yīng)完全，所需K2Cr2O7和濃H2SO4量分別為X和Y，則根據(jù)配平后反應(yīng)式可算出反應(yīng)液中兩物質(zhì)的添加量，保證反應(yīng)過程中乙醇充分氧化。

測定方法:a.配制反應(yīng)液:取K2Cr2O73.4g，加水80m L，充分溶解后緩慢加入濃H2SO42.5m L，冷卻后定容至100m L;b.取康維皿2個(gè)，外圈上邊緣均勻涂抹一層甘油，盡量使涂抹的厚度一致;c.外圈的一側(cè)加入K2CO3飽和溶液，另一側(cè)分別加入蒸餾水和待測液，內(nèi)圈中加入2m L K2Cr2O7－H2SO4溶液，立即蓋好皿蓋后輕輕轉(zhuǎn)動康維皿，使乙醇溶液與飽和K2CO3溶液充分混合;d.在80℃恒溫箱中準(zhǔn)確保溫30m in后，內(nèi)圈反應(yīng)液稀釋4倍，以加入蒸餾水的內(nèi)圈對照液作為空白對照，在最佳吸收波長下掃描，見圖1。

1.2.3 吸收波長的掃描選擇 將標(biāo)準(zhǔn)溶液1作為待測液，其他方法步驟同1.2.2，在波長530～640nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以檢測波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做圖，取曲線最高點(diǎn)處的波長為檢測波長。

1.2.4 繪制乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 取8個(gè)康維皿涂抹好甘油后，各取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液2加入康維皿外圈，其他操作方法同1.2.2，在波長580nm處測定各內(nèi)圈溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，乙醇濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣品乙醇含量測定方法 無需離心、除菌或蒸餾等操作，直接量取發(fā)酵液0.2m L，其他方法步驟同1.2.2，測定各內(nèi)圈溶液吸光度，將讀出的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得出發(fā)酵液中的乙醇含量。

1.2.6 其他分析方法 糖濃度檢測:DNS比色法;醋酸濃度檢測:酸堿滴定法［13］。

圖1 康維皿比色法示例圖Fig.1 Example diagram of KangWei－Utensil

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇反應(yīng)液最大吸收波長的確定

樣品溶液1經(jīng)反應(yīng)后的內(nèi)圈溶液置于不同的波長下檢測其吸光度，選取最大吸收峰處波長作為樣品檢測波長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品液1的吸收光譜圖Fig.2 The absorption spectrum of sample 1

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液1的吸光度A在λ= 580nm處達(dá)到最大值，此時(shí)波長偏差對應(yīng)的吸光度偏差最小，被測組分的靈敏度最高，能有效減小實(shí)驗(yàn)誤差，故選取該波長作為康維皿法測定乙醇濃度的測量波長。

2.2 乙醇測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)配制的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液2檢測值擬合出乙醇和λ=580nm處吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，乙醇－OD580nm標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程在0.5%～1%(v/v)之間呈良好線性，對曲線作回歸分析得相關(guān)系數(shù) R2=0.9995，回歸方程式 Y= 0.07389X－0.00886，其中Y表示吸光度，X表示乙醇濃度，0.00886表示補(bǔ)償參數(shù)。

2.3 密度及抗其他組分干擾的結(jié)果

果醋內(nèi)含有大量的揮發(fā)酸醋酸和少量的糖類、醇類和有機(jī)酸等物質(zhì)，為確保測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)精密度和干擾實(shí)驗(yàn)。在果醋發(fā)酵過程前期和后期各取5個(gè)樣，同時(shí)采用氣相色譜法測定乙醇含量，并將結(jié)果與原康維皿比色法檢測結(jié)果進(jìn)行分析比對，結(jié)果見表1;在標(biāo)準(zhǔn)溶液1中分別加入各類糖、醇類物質(zhì)，并檢測乙醇濃度，將測定結(jié)果與空白對照進(jìn)行對比，結(jié)果見表2。

從表1結(jié)果可知，原康維皿比色法由于缺少精確的顯色液配比和固定的檢測限，造成檢測結(jié)果與實(shí)際值偏差較大;改進(jìn)康維皿比色法測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，對不同發(fā)酵樣品測定數(shù)據(jù)可靠。從檢測成本角度考慮，康維皿可重復(fù)多次使用，并且對樣品前處理和儀器要求小，可以短時(shí)間大批量檢測。

由表2結(jié)果可知，額外添加醋酸等干擾物質(zhì)并不影響乙醇含量的測定，與空白對照相比，檢測結(jié)果波動均在誤差范圍之內(nèi)，使用康維皿能夠有效避免發(fā)酵液中各類糖類、醇類物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

表1 康維皿比色法和氣相色譜法檢測結(jié)果Table 1 Result of KangWei－Utensil and GC

表2 抗干擾度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of anti－interference degrees

圖3 乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of alcohol

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取無水乙醇5m L，用果醋樣品溶液定容至100m L，進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，平行五次，測得結(jié)果計(jì)算回收率，一般回收率在95%～105%之間，結(jié)果見表3。

2.5 果酒及果醋發(fā)酵過程乙醇含量的快速檢測

通過上述研究，初步建立了一種乙醇快速檢測方法，將其應(yīng)用于果醋檢測中，分別對果醋發(fā)酵兩階段乙醇含量進(jìn)行在線即時(shí)檢測，并同時(shí)分別測定糖濃度和產(chǎn)酸強(qiáng)度，以計(jì)算生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率，從而驗(yàn)證該檢測方法對果醋生產(chǎn)適用性。果酒發(fā)酵及乙醇生成速率見圖4、圖5，果醋發(fā)酵及乙醇消耗速率見圖6、圖7。為便于表示，乙醇濃度均以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，換算關(guān)系為1%(v/v)=0.8g/dL。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of recovery test

圖4 果酒發(fā)酵過程Fig.4 Fermentation process of cider

圖5 糖消耗率及乙醇生產(chǎn)速率Fig.5 Spending rate of sugar and production rate of alcohol

由圖4結(jié)果可知，在果酒發(fā)酵階段除發(fā)酵前期和后期由于菌體活力不足造成產(chǎn)醇速率較慢，糖度的下降與乙醇濃度的上升趨勢相同，發(fā)酵80h后糖濃度下降至5g/L時(shí)，接近發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，生成的乙醇濃度為5.3g/dL。由圖5可知，在發(fā)酵過程中，單位時(shí)間糖的消耗量與乙醇生成量基本相同，轉(zhuǎn)化率維持在46%左右，終轉(zhuǎn)化率為45.6%?？稻S皿檢測法能夠準(zhǔn)確反映出果酒發(fā)酵過程中的乙醇生成情況，檢測結(jié)果不受果酒發(fā)酵液復(fù)雜體系中糖類、醇類物質(zhì)變化的影響，從而能夠有效的指導(dǎo)生產(chǎn)。

圖6 果醋發(fā)酵過程Fig.6 Fermentation process of vinegar

圖7 乙醇消耗速率及醋酸生產(chǎn)速率Fig.7 Spending rate of alcohol and production rate of acetic acid

由圖6、圖7結(jié)果可知，果醋發(fā)酵時(shí)，每消耗1g/dL乙醇生成的醋酸量約為1g/dL，發(fā)酵52h時(shí)乙醇濃度降至0.5g/dL以下，此時(shí)酸度為4.92g/dL，終轉(zhuǎn)化率為98.4%，生產(chǎn)過程中乙醇－醋酸轉(zhuǎn)化率約為98%，與實(shí)驗(yàn)值基本相同。此步發(fā)酵過程中的乙醇含量亦采用康維皿比色法測定，在更為復(fù)雜的果醋發(fā)酵液中，數(shù)據(jù)同樣準(zhǔn)確可靠，有效地提高了檢測效率，能夠?qū)装l(fā)酵整個(gè)過程進(jìn)行即時(shí)監(jiān)測，通過測定發(fā)酵過程中殘留乙醇含量了解發(fā)酵情況，在發(fā)生發(fā)酵異常等情況時(shí)進(jìn)行合理調(diào)整。

3 結(jié)論

果醋釀造以乙醇為底物，生產(chǎn)過程中需要跟蹤分析醇酸的消長關(guān)系，以便優(yōu)化工藝過程。終產(chǎn)品乙醇含量需要準(zhǔn)確測定，是判斷發(fā)酵是否完全的首要條件。隨著國內(nèi)果醋市場的逐步開發(fā)以及果醋飲料標(biāo)準(zhǔn)的出臺，專門針對果醋相關(guān)發(fā)酵參數(shù)的檢測顯得尤為重要，因此建立快速準(zhǔn)確的檢測方法勢在必行［14－15］。

果醋發(fā)酵液是由酸類、醇類、醛類、酯類和酚類物質(zhì)組成的復(fù)雜體系［16］，傳統(tǒng)檢測方法易受成分波動而造成測定不準(zhǔn)。本文對康維皿比色法測定乙醇進(jìn)行了一定改進(jìn)，固定了反應(yīng)液的配制濃度，通過精密度和抗干擾度等實(shí)驗(yàn)保證了檢測結(jié)果精確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:采用康維皿作為反應(yīng)容器，在580nm處測定，乙醇濃度在0.5%～10%(v/v)之間呈良好線性，測定精密度 RSD為0.4248%，平均回收率為100%，重現(xiàn)性良好。并通過果酒發(fā)酵和果醋發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明該檢測方法的時(shí)效性。整個(gè)檢測過程不需要精密的檢測儀器，與傳統(tǒng)乙醇檢測方法相比，不僅取樣量少，減少了檢測的工作量，而且不需要過濾蒸餾等前處理操作，受環(huán)境影響小，能準(zhǔn)確反映出果酒釀造以及醋酸釀造兩階段乙醇含量變化情況，有利于對整個(gè)果醋生產(chǎn)過程的監(jiān)控，為快速測定果醋發(fā)酵液殘留乙醇含量提供了一種較為方便、準(zhǔn)確的方法，隨著果醋產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，該檢測方法將得到更為廣泛的應(yīng)用。

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Rapid assay of residue alcohol in the fermentation liquid of fruit vinegar

LIU Zhi－peng，YANG Hai－lin，XIA Xiao－le，ZHANG Ling，WANG W u*
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

A rap id method was developed for detec ting residue alcohol in fruit vinegar accord ing to KangWei－Utensil colorimetric method p rincip le.The result showed that，the maximum absorbance waveleng th of alcoholwas 580nm using KangWei－Utensilas reac tion container.There was a good linear relationship w ith R2=0.9995 w ithin the range from 0.5%～10%(v/v)，regression equation was Y=0.07389X－0.00886.Due to the advantages of rap id，convenient，and com p lex equipm ent non－required，the m ethod was not only suitab le for detec ting the alcohol content in fruit vinegar，but also tracking the change of alcohol during fermentation p rocess.The method m ight be app lied on other biop rocesses which involving w ith detection of ethanol residue or finalethanol concentration.

KangWei－Utensil;rap id detection;residue alcohol;fruit vinegar

TS255.47

A

1002－0306(2012)12－0079－04

2011－09－30 *通訊聯(lián)系人

劉志鵬(1986－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:生物工程。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(JUSRP111A25)。