郭 濤，馬重華，王 雅，*，周尚臻，劉薈萃，趙春萌

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州 730050）

響應(yīng)面優(yōu)化南瓜果肉多酚提取工藝及抗氧化性能研究

郭 濤1，馬重華2，王 雅1，*，周尚臻1，劉薈萃1，趙春萌1

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州 730050）

對(duì)南瓜果肉多酚提取工藝及抗氧化性能進(jìn)行了研究。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，研究超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇濃度和料液比對(duì)南瓜果肉多酚提取效果的影響；通過(guò)還原力和DPPH自由基清除法對(duì)南瓜果肉多酚的抗氧化活性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南瓜果肉多酚最佳提取工藝條件為：超聲功率237.2W、超聲時(shí)間11.65min、乙醇濃度96.80%、料液比為1∶21.4（g/mL），此條件下實(shí)際南瓜果肉多酚得率為5.629%；四個(gè)因素對(duì)南瓜多酚得率影響的主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞乙醇濃度＞料液比＞超聲功率；南瓜果肉多酚具有一定還原力和清除DPPH·的能力，且在一定范圍內(nèi)，多酚濃度與其抗氧化活性呈明顯的線性關(guān)系。

南瓜果肉多酚，超聲波輔助提取，響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，抗氧化性能

南瓜是葫蘆科南瓜屬一年蔓性草本科植物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)南瓜含有多種生理活性物質(zhì)，具有很高的藥用價(jià)值，已被國(guó)內(nèi)外公認(rèn)為特級(jí)保健品，是集食品、保健品、藥品為一身的營(yíng)養(yǎng)保健品[1]。南瓜的功能成分研究有環(huán)丙基氨酸、南瓜多糖、南瓜粗纖維、β-胡蘿卜素、果膠、南瓜葫蘆巴堿等[2]。目前，對(duì)南瓜果肉多酚的研究未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用周期短、精度高的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]優(yōu)化了南瓜果肉多酚的提取工藝，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，為南瓜果肉多酚的研究提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜（冠龍F(tuán)1） 2011年6月購(gòu)自蘭州西太華超市，南瓜洗凈后，將其果肉真空冷凍干燥，粉碎后過(guò)0.38mm篩；二苯代苦味?；杂苫―PPH·）、沒(méi)食子酸 分析純，Sigma-Aldrich；VC分析純，天津市醫(yī)藥工業(yè)技術(shù)研究所；硫酸鋰 分析純，天津市天河化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；氯化鐵 分析純，天津市雙船化學(xué)試劑廠。

UV-9200紫外可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-1-55真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 福林酚試劑（FC試劑）的制備 在1L磨口回流蒸餾器中加入50g鎢酸鈉、12.5g鉬酸鈉、350mL蒸餾水、85%磷酸25mL和37%鹽酸50mL，冷凝回流10h，之后取下冷凝管，添加75g硫酸鋰和3滴雙氧水，重新加熱至沸，維持15min，除去多余雙氧水后冷卻，然后用蒸餾水定容至500mL，并轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中置于冰箱中4℃冷藏備用（使用前稀釋10倍）。

1.2.2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[4]準(zhǔn)確稱取0.2500g沒(méi)食子酸，用70%乙醇溶液定容至50mL，分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5mL上述沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液到50mL容量瓶中，用蒸餾水定容，制得質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.15、0.25、0.5mg/mL的沒(méi)食子酸溶液，從上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取0.5mL到50mL比色管中，加入1mL FC試劑，在0.5～8min內(nèi)加入5mL碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至25mL并混合均勻，室溫下放置60min后在765nm處測(cè)吸光值。每個(gè)濃度做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度值Y與沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X（mg/mL）之間的回歸關(guān)系為：Y=1.1805X+0.0278，R2=0.9921。

1.2.3 南瓜果肉多酚的提取[5]稱取南瓜果肉粉2.000g，按一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇和一定的料液比、超聲功率、超聲時(shí)間進(jìn)行超聲提取后，5000r/min離心10min，取上清液測(cè)其多酚含量并計(jì)算多酚得率：

式中：m為樣液中南瓜果肉多酚質(zhì)量（g）；M為南瓜果肉質(zhì)量（g）。

1.2.4 南瓜果肉多酚超聲輔助提取的單因素實(shí)驗(yàn)[6-7]

分別研究乙醇濃度、超聲功率、料液比和超聲時(shí)間對(duì)南瓜多酚得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素對(duì)南瓜果肉多酚得率的影響，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 7.1.4建立4因素3水平的Box-Behnken模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝。以南瓜果肉多酚得率（%）為響應(yīng)值，超聲功率（X1）、超聲時(shí)間（X2）、乙醇濃度（X3）、料液比（X4）為自變量，變量編碼值根據(jù)式（2）確定。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平編碼值Table 1 Factors and levels of experiment design

其中χi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，△X為自變量的變化步長(zhǎng)。4個(gè)自變量因素編碼及水平見表1。

1.2.6 南瓜果肉多酚的純化 將南瓜果肉多酚提取液經(jīng)NKA-9大孔樹脂純化，冷凍干燥，測(cè)得其多酚純度為84%，進(jìn)行抗氧化活性研究。

1.2.7 南瓜果肉多酚抗氧化活性的測(cè)定 還原能力測(cè)定[9]和DPPH·清除能力[10-11]的分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)南瓜果肉多酚得率的影響 在超聲時(shí)間10min、料液比1∶16、乙醇濃度60%的條件下，研究超聲功率對(duì)南瓜果肉多酚得率的影響。如圖1所示，隨著超聲功率的增大，多酚得率增大，當(dāng)超聲功率達(dá)到240W時(shí)多酚得率最高；而當(dāng)超聲功率大于240W時(shí)多酚得率開始降低。在一定時(shí)間內(nèi)，超聲功率越高，體系升溫越快，固液擴(kuò)散速度也越快，有利于物料中有效成分的浸出；但超聲功率過(guò)高，體系溫度升高導(dǎo)致多酚類物質(zhì)降解，從而使多酚得率下降。所以最佳超聲功率為240W。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 在超聲功率240W、乙醇濃度60%，料液比1∶16的提取條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響。從圖2可以看出，當(dāng)超聲時(shí)間為10min時(shí)多酚得率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多酚得率開始下降，這可能是因?yàn)樘崛∪軇囟鹊牟粩嗌咭约疤崛r(shí)間的延長(zhǎng)，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)降解，從而使多酚提取率下降。另外，時(shí)間越長(zhǎng)，耗能越大，所以取最佳超聲時(shí)間為10min。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield

2.1.3 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響 在超聲時(shí)間10min、超聲功率240W、料液比1∶16的提取條件下，研究乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響。如圖3所示，隨著乙醇濃度的增大，多酚得率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為95%時(shí)，南瓜果肉多酚得率最大，若再繼續(xù)增大乙醇濃度，多酚得率有所下降，因此，最佳乙醇濃度為95%。在乙醇溶劑中多酚類物質(zhì)處于游離狀態(tài)，增加了組織的通透性，得率最高，也可能是由于南瓜果肉中醇溶性多酚含量較多。

圖3 乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield

2.1.4 料液比對(duì)多酚得率的影響 在超聲時(shí)間10min、超聲功率240W、乙醇濃度95%的提取條件下，研究料液比對(duì)多酚得率的影響。圖4表明，隨著料液比的增大多酚得率提高，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)多酚得率達(dá)到最高，再繼續(xù)增大時(shí)呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榱弦罕葹?∶20時(shí)，溶劑對(duì)多酚的溶解已經(jīng)達(dá)到了飽和，繼續(xù)增大溶劑用量，并不能顯著提高多酚的提取量，因此選最佳液料比為1∶20。

圖4 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Effect of ratio of materiel to solvent on yield

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 運(yùn)用Design Expert 7.1.4對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值—多酚得率（Y）與4個(gè)因素二次多項(xiàng)式回歸模型為：

由表3可知，模型P=0.0002<0.01，表明模型極其顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.8944，說(shuō)明用該模型可以解釋89.44%響應(yīng)值的變化。該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)南瓜果肉多酚提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由表4可知，一次項(xiàng)X2、X3，交叉項(xiàng)X1X3、二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42對(duì)多酚得率的影響極顯著，依據(jù)參數(shù)估計(jì)值可知影響因子的主效應(yīng)主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞乙醇濃度＞料液比＞超聲功率。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 4 Significance estimation of regression coefficients

為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)的數(shù)值，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其等于零，得如下方程：

求解得χ1=-0.07；χ2=0.33；χ3=0.36；χ4=0.28，代入編碼公式得多酚提取的最佳工藝：X1（超聲功率）=237.2W；X2（超聲時(shí)間）=11.65min；X3（乙醇濃度）=96.80%；X4（料液比）=1∶21.4（g/mL）。

2.2.2 模型驗(yàn)證 結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析結(jié)果，超聲波輔助提取南瓜果肉多酚的最佳工藝參數(shù)為：超聲功率為237.2W，超聲時(shí)間為11.65min，乙醇濃度為96.80%，料液比為1∶21.4（g/mL）。在此條件下南瓜果肉多酚理論得率為5.667%，實(shí)際南瓜果肉多酚得率為5.629%，兩者非常接近，說(shuō)明該模型可靠。

根據(jù)回歸方程可以繪制各因素對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖。等高線圖同一曲線上多酚得率相同，圖形中心多酚得率最高，從中心到邊緣得率逐漸降低。等高線圖沿某一因素軸方向曲線密度越大，說(shuō)明多酚得率對(duì)該因素的變化越敏感，其影響因子越高，反映在響應(yīng)曲面上則是曲面坡度越陡峭，反之，則其影響因子越小。等高線圖的形狀則可反映因素間交互作用的強(qiáng)弱，圖形趨向橢圓且橢圓軸線與坐標(biāo)軸的角度越大，則交互作用越明顯，反之則交互作用越弱[12]。根據(jù)這些性質(zhì)分析所有等高線圖與相應(yīng)曲面，可以得出各因素影響因子的排列為：超聲時(shí)間＞乙醇濃度＞料液比＞超聲功率，結(jié)果與2.2.1的參數(shù)估計(jì)結(jié)果相同。

圖5所示在超聲功率較低的條件下，乙醇濃度的變化能顯著影響多酚的得率，而在高超聲功率條件下，乙醇濃度對(duì)得率的影響明顯減弱，這說(shuō)明這兩個(gè)因素之間存在拮抗作用，這與回歸方程中的X1X3系數(shù)為負(fù)號(hào)相吻合。

圖5 乙醇濃度和超聲功率對(duì)多酚得率交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of mutual-action for ultrasonic power and ethanol concentration on polyphenol content

2.3 南瓜果肉多酚的抗氧化性能

2.3.1 南瓜果肉多酚的還原力 由圖6可知，南瓜果肉多酚具有一定的還原能力，且質(zhì)量濃度在1.0～3.0mg/mL之間，其還原能力隨質(zhì)量濃度的增加而升高。

2.3.2 南瓜果肉多酚對(duì)DPPH·清除能力 圖7表明，南瓜果肉多酚有一定的清除DPPH·的能力，且清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。

圖6 南瓜果肉多酚的還原力Fig.6 The reducing power of pumpkin pulp polyphenol of pumpkin pulp polyphenol

圖7 南瓜果肉多酚對(duì)DPPH·的清除率Fig.7 Effect of scavenging DPPH·on pumpkin pulp polyphenol

3 結(jié)論

選用乙醇為提取劑，通過(guò)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化南瓜果肉多酚的提取工藝，得到最佳提取條件：超聲功率為237.2W，超聲時(shí)間為11.65min，乙醇濃度為96.80%，料液比為1∶21.4（g/mL），此條件下實(shí)際南瓜果肉多酚得率為5.629%。方差分析結(jié)果表明，四個(gè)因素對(duì)多酚得率影響的主次順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞乙醇濃度＞料液比＞超聲功率。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究表明：南瓜果肉多酚具有較好的還原力和DPPH·清除能力，說(shuō)明其具有較好的抗氧化活性，且在一定范圍內(nèi)，多酚濃度與其抗氧化活性呈顯著的線性關(guān)系。

[1]王燕，車振明.南瓜的功能特性及其深加工[J].食品研究與開發(fā)，2005，26（3）：7-10.

[2]鄒宇曉，肖更生.南瓜的功能性成分及保健食品開發(fā)與研究[J].中國(guó)果菜，2004（4）：48-49.

[3]史妍妍，孫志禮，閆明.響應(yīng)面方法在可靠性靈敏度計(jì)算中的應(yīng)用[J].東北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，30（2）：270-273.

[4]繆曉平，鄧開野，譚梅唇.蘋果渣中多酚物質(zhì)的提取工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（20）：11004-11005.

[5]李金鳳，段玉青，馬海樂(lè)，等.板栗殼中多酚的提取及體外抗氧化性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2010，30（1）：53-57.

[6]李西柳，龐明，王俊儒，等.柿子渣中多酚的提取工藝及抗氧化性研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（7）：1475-1480.

[7]Zhishen J，Mengcheng T，Jianming W.The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals[J].Food.Chem.，1999，64（4）：555-559.

[8]白雪蓮，岳田利，章華偉，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取蘋果渣多酚工藝研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2010，10（4）：169-176.

[9]趙萍，王雅，張軼，等.葵花籽粕的乙醇提取物的抗氧化活性研究學(xué)[J].食品科學(xué)，2007，28（10）：219-222.

[10]Aruomaoi.Nutrition and health aspects of free radical sand antioxidants[J].Food Chemistry Toxic，1994，32（7）：671-683.

[11]Sánchez-Moreno C，Larrauri J A，Saura-Calixto F.A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols[J].Journal Sciences Food Agriculture，1998，76（2）：270-276.

[12]劉奉強(qiáng)，肖鑒謀，劉太澤.應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取荊芥中總黃酮的工藝[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)：工科版，2011，33（2）：149-155.

Study on optimization of extraction technology for pumpkin pulp polyphenol by response surface method and its antioxidant activity

GUO Tao1，MA Chong-hua2，WANG Ya1，*，ZHOU Shang-zhen1，LIU Hui-cui1，ZHAO Chun-meng1
（1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China;2.College of Petrochemical Technology，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

The extraction technology and antioxidant activity of pumpkin pulp polyphenol were studied.And influences of the ultrasonic power,ultrasonic time，ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction of pumpkin pulp polyphenol were studied through single factor experiments and response surface experiment.The antioxidant activity of pumpkin pulp polyphenol was also studied by reducing power and DPPH radical scavenging method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：ultrasonic power 237.2W，ultrasonic time 11.65min，96.80%ethanol，ratio of solid to liquid 1∶21.4(g/mL)，and under this conditions，the yield of polyphenol was 5.629%.The primary and secondary order of four factors affecting on extraction rate of pumpkin polyphenol were ultrasonic time>ethanol concentration>ratio of solid to liquid>ultrasonic power.Pumpkin pulp polyphenol possesses reducing power and activity to remove DPPH·，the concentration of polyphenol showed a linear relationship with its antioxidant activity to some extent.

pumpkin pulp polyphenol；response surface method；ultrasonic assisted extraction；antioxidation

TS255.36

B

1002-0306（2012）07-0315-05

2011－08－31 * 通訊聯(lián)系人

郭濤（1976-），男，博士，講師，主要從事食品、制藥工程研究。

蘭州理工大學(xué)“學(xué)科協(xié)調(diào)發(fā)展計(jì)劃”資助。