高 遠(yuǎn), 李富超 姜 鵬 秦 松 欒錫武 秦蘊(yùn)珊

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

鄂霍次克海冷泉沉積物真核生物多樣性的初步研究

高 遠(yuǎn)1,2, 李富超1, 姜 鵬1, 秦 松1, 欒錫武1, 秦蘊(yùn)珊1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

從鄂霍次克海沉積物樣品中提取總基因組DNA, 進(jìn)行核糖體rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的擴(kuò)增, 構(gòu)建克隆文庫(kù)并進(jìn)行測(cè)序, 對(duì)該環(huán)境下真核生物的多樣性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 該環(huán)境下的真核生物具有較高的多樣性, 主要為 3大類, 真核藻類、真菌和微型浮游動(dòng)物。藻類和微型浮游動(dòng)物的組成與前人在該海域浮游生物生態(tài)學(xué)的研究相吻合, 而真菌群落具有較高的多樣性, 這為該區(qū)域真核生物多樣性、所參與的生物地球化學(xué)過程及生態(tài)學(xué)意義的研究奠定了基礎(chǔ)。

冷泉沉積物; 核糖體rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū); 真核生物多樣性

冷泉是指溫度接近于海水, 而以高于周圍水環(huán)境濃度的烴類化合物(主要為甲烷)、硫化物或二氧化碳為主要成分, 受地質(zhì)構(gòu)造或壓力梯度作用滲出沉積物表層的流體[1]。海底冷泉作為一種極端環(huán)境具有獨(dú)特的生物多樣性和極高的生物密度[2], 該環(huán)境下的生物群落逐漸被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道, 已成為地質(zhì)學(xué)、生物學(xué)的研究熱點(diǎn), 為地球生物化學(xué)、生命演化和極端生命的研究提供了機(jī)遇。

通過環(huán)境樣品基因序列的分析來研究環(huán)境生物多樣性被廣泛應(yīng)用于原核微生物生態(tài)學(xué)研究, 并已成為不可或缺的研究手段[3]。然而該方法在真核生物生態(tài)學(xué)方面尚未被普遍采用。Heath[4]曾通過該方法對(duì)森林土壤環(huán)境樣品中的真菌群落進(jìn)行過研究, 其使用了真核生物通用的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物 ITS1/ITS4, 發(fā)現(xiàn)相對(duì)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法, 該方法發(fā)現(xiàn)了極為豐富的生物多樣性, 而與 DGGE等指紋圖譜方法相比能夠提供前者所不能提供的完全的物種信息。Lai等[5]通過構(gòu)建 ITS的克隆文庫(kù), 分析了南海甲烷水合物富集區(qū)的真菌群落多樣性。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)是真核生物中分隔核糖體大亞基與小亞基rRNA基因的區(qū)域, 由于其進(jìn)化速率較快, 可用于很多真菌、植物和藻類屬和種水平上的識(shí)別和鑒定。目前對(duì)于該序列, 已經(jīng)具有基因信息量很大的數(shù)據(jù)庫(kù)[6], 這為該序列在多樣性研究方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

鄂霍次克海位于太平洋的西北角, 千島島弧的內(nèi)側(cè), 海域面積僅次于中國(guó)的南海, 是西北太平洋大陸邊緣中第二大邊緣海, 其三面被高聳的山脈環(huán)繞, 這為該地區(qū)提供了大量有機(jī)及無機(jī)的沉降顆粒[7], 通過對(duì)海底沉積物中生物多樣性的研究將對(duì)該海域浮游生物生態(tài)學(xué)提供佐證。同時(shí)由于鄂霍次克海的海底是一種典型的冷泉環(huán)境, 在該海域進(jìn)行該類研究還將有助于對(duì)極端生命的探索。

1 材料與方法

1.1 采樣

2006年5月由俄、韓、日、中四國(guó)共同組織的鄂霍次克海天然氣水合物聯(lián)合調(diào)查航次, 取得了海底表層沉積物的柱狀樣品。沉積物樣品名： LV39-18H;采樣深度： 715 m; 經(jīng)緯度： 54°29.92′N, 144°16.53′E;由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋地質(zhì)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 DNA的提取

通過FastDNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals,美國(guó))試劑盒對(duì)該柱狀沉積物 0～40 cm 的表層樣品0.35 g進(jìn)行總DNA的提取。

1.3 真核生物ITS片段的擴(kuò)增

1.3.1 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

使用 ITS通用引物 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC)[8], 使用實(shí)驗(yàn)方法1.2中提取的DNA作為模板。PCR反應(yīng)體系如下： DNA模板 0.5 μL; ITS1引物(10 μmol/L)1 μL, ITS4 引物(10 μmol/L)1 μL; 2×MasterMix Taq酶 12.5 μL (天根生化科技有限公司, 中國(guó));Mili Q水補(bǔ)至 25μL。使用 Biometra Tprofessional PCR儀(德國(guó)), 反應(yīng)條件如下： 94°C預(yù)變性 6 min;94°C 50 s, 50°C 50 s, 72°C 70 s, 循環(huán) 30 次; 72°C 延伸10 min。

1.3.2 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)

使用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳, 溴化乙錠染色后于紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國(guó))下進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 構(gòu)建克隆文庫(kù)

使用 DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Bioteke, 中國(guó))對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收。與克隆載體pMD18-T(TaKaRa, 日本)連接并轉(zhuǎn)化到Escherichia coliTop10(Invitrogen, 加拿大)細(xì)胞中, 于 37°C 恒溫培養(yǎng)過夜。挑取48個(gè)單菌落, 送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 序列分析

通過 BLAST軟件從 GenBank獲得與本實(shí)驗(yàn)所得到序列親緣關(guān)系最近的序列。使用 CLUSTAL W軟件[9]進(jìn)行多序列比對(duì)。根據(jù)97%的分類標(biāo)準(zhǔn), 將所得的序列使用 DOTUR軟件[10]進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育類型的歸類。使用DOTUR對(duì)文庫(kù)進(jìn)行各統(tǒng)計(jì)學(xué)指數(shù)的分析：稀有度曲線作為判斷文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育類型豐富度的參考; Shannon多樣性指數(shù)用來評(píng)價(jià)系統(tǒng)發(fā)育類型多樣性; Chao1 豐富度指數(shù)用來推斷樣品中物種總數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)所得序列的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì) 48個(gè)單菌落進(jìn)行測(cè)序, 去除不成功的序列,共獲得 38條序列, 通過 DOTUR軟件分析, 所有序列根據(jù) 97%的分類標(biāo)準(zhǔn)被劃分為 19個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型。

通過 BLAST檢索, 發(fā)現(xiàn)所有的 38條序列主要來自3大類, 分別為藻類(19條序列)、真菌(8條序列)和浮游動(dòng)物(11條序列), 分別占克隆總數(shù)的 50%,21.1%和28.9%。3大類群中具體門類所占比例如圖1所示, 對(duì)各大類群的統(tǒng)計(jì)分析如表1所示, 各大類群在文庫(kù)中的稀有度曲線如圖2所示。

圖1 各真核生物類群占ITS克隆文庫(kù)的比例Fig. 1 Proportion of each eucaryotic group in the ITS clone library藻類用交叉線表示, 真菌用直線表示, 浮游動(dòng)物用點(diǎn)表示Algae represented by crossed lines, fungi represented by straight lines and zooplankton represented by dots

表1 對(duì)真核生物ITS文庫(kù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tab. 1 Statistical analysis of ITS library

圖2 ITS克隆文庫(kù)各類群的稀有度曲線Fig. 2 Rarefaction curve of each group in the ITS clone library

具體來說, 根據(jù)Shannon多樣性指數(shù)顯示, 真菌的多樣性最高, 達(dá)到2.08, 浮游動(dòng)物多樣性最低, 為1.04。Chao1指數(shù)也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì), 真菌的Chao1指數(shù)達(dá)到36, 而浮游動(dòng)物該指數(shù)僅為3。就整個(gè)ITS文庫(kù)來說, Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別達(dá)到2.56和38.5。

從稀有度曲線可以看出, 隨著克隆抽樣次數(shù)的增加, 真菌系統(tǒng)發(fā)育類型數(shù)目表現(xiàn)出同步增長(zhǎng)趨勢(shì),即完全未達(dá)到飽和。與此相反, 浮游動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育類型基本達(dá)到飽和并最終穩(wěn)定在 3左右, 而藻類表現(xiàn)出部分飽和。

2.2 真核生物多樣性

2.2.1 藻類多樣性

屬于藻類的19條序列可被劃分為8個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型。具體來說, 5個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型屬于硅藻, 另有2個(gè)和 1個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型分別屬于綠藻和甲藻。其中屬于3個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型的12條序列與硅藻角毛藻屬(Chaetoceros)的親緣關(guān)系最高(相似度分別為 97%、92%和 93%), 該屬為藻類中的優(yōu)勢(shì)類群, 占藻類總克隆數(shù)目的63.2%。另有屬于2個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型的3條序列與綠藻門的海洋綠色微藻Koliella spiculiformis的親緣關(guān)系最高(相似度分別91%和90%)。此外還發(fā)現(xiàn)了 4條序列分別與硅藻門雙環(huán)海鏈藻屬(Thalassiosira, 一條序列, 相似度 85%)和短縫藻屬(Eunotia, 兩條序列, 相似度87%)以及甲藻門裸甲藻屬(Gymnodinium, 一條序列, 相似度 84%)有較低的相似度。

2.2.2 真菌多樣性

屬于真菌的所有 8條序列分別屬于不同的系統(tǒng)發(fā)育類型, 即共可劃分為8個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型。它們分別來自壺菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門和子囊菌門, 另有3條序列分別與環(huán)境樣品中獲得的ITS序列親緣關(guān)系最近, 目前尚無法具體鑒定。其中來自子囊菌門的序列與海洋酵母菌梅奇酵母屬(Metschnikowia)有93%的相似度。

2.2.3 浮游動(dòng)物多樣性

屬于浮游動(dòng)物的11條序列可被劃分為3個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型, 經(jīng)過BLAST檢索發(fā)現(xiàn), 所有3個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型都屬于 20～200 μm 微型浮游動(dòng)物的纖毛蟲,其中兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型的序列與無殼纖毛蟲的Strombidium具有較高同源性(相似度為98%和96%),而另一系統(tǒng)發(fā)育類型的序列與砂殼纖毛蟲的Tintinnopsis具有較高同源性(相似度為97%)。

3 討論

從鄂霍次克海沉積物樣品中提取總基因組 DNA,進(jìn)行 ITS基因的擴(kuò)增并構(gòu)建文庫(kù)對(duì)該環(huán)境下真核生物的多樣性進(jìn)行了研究。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析特別是 Shannon指數(shù)提示, 在該冷泉沉積物環(huán)境中真菌具有極高的多樣性, 而浮游動(dòng)物的多樣性最低。根據(jù)飽和曲線顯示出相似結(jié)果, 由于挑取的克隆數(shù)較少, 真菌多樣性曲線完全未達(dá)到飽和, 但是浮游動(dòng)物多樣性已基本達(dá)到飽和。基于以上多樣性分析, 我們建議使用真菌特異的 ITS引物或增加測(cè)序克隆數(shù)目, 以對(duì)真菌類群的多樣性進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本文中發(fā)現(xiàn)的藻類序列大部分來自能引起赤潮的浮游藻類。其中角毛藻在許多文獻(xiàn)中記載為鄂霍次克海域最主要的浮游藻類[11], 本文的結(jié)果也與前人對(duì)浮游生態(tài)學(xué)的研究相吻合。有趣的是, 在我們對(duì)該沉積物 16S rRNA基因構(gòu)建的克隆文庫(kù)中也發(fā)現(xiàn)了占該文庫(kù)較高比例的角毛藻屬葉綠體 16S rRNA基因(數(shù)據(jù)未發(fā)表), 且此類群在沉積年代數(shù)萬年的深度仍有發(fā)現(xiàn), 因此推測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)的這些序列很可能來自這類浮游硅藻產(chǎn)生的隨沉積作用進(jìn)入沉積物的休眠細(xì)胞。此外與赤潮藻類硅藻門雙環(huán)海鏈藻屬和甲藻門裸甲藻屬有一定親緣關(guān)系的序列在本文中也有發(fā)現(xiàn)?？傮w來說, 硅藻在所有這些赤潮藻類中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì), 這可能是因?yàn)榕c甲藻等其他赤潮藻類相比, 硅藻主要采取r-對(duì)策, 即通過產(chǎn)生大量的有數(shù)月乃至幾年生活力的休止細(xì)胞, 能夠迅速適應(yīng)適宜環(huán)境。在海底沉積物中, 硅藻休止細(xì)胞數(shù)目占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象也屢次通過常規(guī)生態(tài)學(xué)方法檢測(cè)到并被報(bào)道[12]。

本文中發(fā)現(xiàn)的真菌多樣性大大高于其余兩大類群, 這提示在海洋沉積物環(huán)境中的真菌群落有可能為我們提供豐富的藥源和基因資源, 比如梅奇酵母屬是重要的海洋酵母菌, 已有對(duì)其酸性蛋白酶基因進(jìn)行開發(fā)的相關(guān)報(bào)道[13]。因此對(duì)海洋真菌的進(jìn)一步研究將有著重要的應(yīng)用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

無殼纖毛蟲和沙殼纖毛蟲是兩類主要的 20～200 μm微型浮游動(dòng)物, 在世界許多海域具有較高的生物量[14]。本研究發(fā)現(xiàn)的上述兩類浮游動(dòng)物的序列, 分別屬于Strombidium和Tintinnopsis。前者為鄂霍次克海中一種優(yōu)勢(shì)浮游動(dòng)物[15], 而后者在鄂霍次克海的分布也早在1932年就由Hada[16]報(bào)道過。

4 結(jié)論

本文的序列大部分來源于鄂霍次克海中的浮游藻類和浮游動(dòng)物, 通過沉降作用到達(dá)沉積物中, 本文的研究在一定程度上為浮游生態(tài)學(xué)的研究提供了佐證。真菌是本研究中發(fā)現(xiàn)的 3大類群中多樣性最高的類群, 對(duì)該類群的進(jìn)一步研究將有重要的科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外, 本研究也證明通過對(duì)ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)而構(gòu)建克隆文庫(kù)的分子生物學(xué)方法確實(shí)能夠發(fā)現(xiàn)較高的多樣性并方便進(jìn)行有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,這為今后對(duì)該區(qū)域真核生物特別是真菌的多樣性、所參與的生物地球化學(xué)過程及生態(tài)學(xué)意義的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Study of eukaryotic diversity in cold seep sediment of the Okhotsk Sea

GAO Yuan1,2, LI Fu-chao1, JIANG Peng1, QIN Song1, LUAN Xi-wu1,QIN Yun-shan1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

May,11,2011

cold seep sediments; internal transcribed spacers; eukaryotic diversity

The eukaryotic diversity in the sediment sampled from the Okhotsk Sea was evaluated using direct isolation of internal transcribed spacer (ITS) rRNA genes by PCR and sequencing of cloned fragments. It is shown from the results that the eukaryotic community exhibited high diversity and all of the sequences were from three groups：algae, fungus and microzooplanktons. The constructions of algal and microzooplanktonic communities were consistent with previous ecological research results in this area. Interestingly, we found that the fungal community showed relatively high diversity, which provided clues for further research.

X17

A

1000-3096(2012)05-0029-05

2011-05-11;

2011-07-23

中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程項(xiàng)目——深海極端環(huán)境微生物生命過程研究(KZCX2-YW-JC201), 深海沉積物中甲烷代謝相關(guān)微生物群落的元基因組學(xué)探索性研究(KSCX-2-YW-G-022, 2007-1); 中國(guó)大洋協(xié)會(huì)項(xiàng)目——深部生物圈微生物活動(dòng)在沉積物和間隙水中的地球化學(xué)記錄研究(DYXM-115-02-2-17)

高遠(yuǎn)(1983-), 男, 山東青島人, 碩士研究生, 主要從事深海微生物生態(tài)學(xué)研究, E-mail： gy.james@163.com; 秦松, 通信作者,男, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 主要從事海洋生物工程研究, E-mail：sqin@ms.qdio.ac.cn

(本文編輯：張培新)