李文娟, 劉楚吾, 劉 麗, 廖寶林

(1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 , 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524025;2. 徐聞珊瑚礁國家級(jí)自然保護(hù)區(qū), 廣東 湛江 524100)

利用ITS基因研究徐聞濱珊瑚的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

李文娟1, 劉楚吾1, 劉 麗1, 廖寶林2

(1. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 , 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524025;2. 徐聞珊瑚礁國家級(jí)自然保護(hù)區(qū), 廣東 湛江 524100)

分別研究了徐聞3種濱珊瑚的ITS1和ITS2基因的堿基組成和G+C含量, 并和已上傳至Genbank上的其他9種濱珊瑚的ITS序列進(jìn)行比較, 研究了徐聞3種濱珊瑚的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。序列分析結(jié)果顯示, 3種濱珊瑚的ITS1的長度為205 bp～209 bp, G+C含量為37.6%～45.5%, ITS2的長度為192 bp～226 bp,G+C含量為45.1%～50.7%, 利用MEGA4.1軟件計(jì)算濱珊瑚屬基于ITS1和ITS2基因的平均遺傳距離分別為0.097和0.200?；贗TS1和ITS2的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹都顯示出, 灰黑濱珊瑚位于進(jìn)化樹的基部,是原始的類群, 普格濱珊瑚是進(jìn)化類群, 澄黃濱珊瑚是過渡類群。

濱珊瑚; ITS基因; 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

濱珊瑚屬(Porites link)屬刺細(xì)胞動(dòng)物門(Cnidaria), 六放珊瑚亞綱(Anthozoa), 石珊瑚目(Scleractinia), 濱珊瑚科(Poritidae Gray)。濱珊瑚屬的珊瑚都是群體, 主要由外觸手芽形成群體, 珊瑚群體小, 珊瑚之間有少量的共骨緊密相連[1]。濱珊瑚在生長的時(shí)候, 骨骼中的碳酸鈣在積聚時(shí)會(huì)因環(huán)境的影響而有不同的密度, 因此濱珊瑚屬可提供關(guān)于過去的氣候資料[2], 全球氣候變化使濱珊瑚面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn), 珊瑚礁白化的加劇迫使人們研究它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。傳統(tǒng)的石珊瑚分類依據(jù)于骨骼, 但是由于石珊瑚具有形態(tài)可塑性, 傳統(tǒng)的分類方法具有一定的局限性, 往往存在同種異名的現(xiàn)象, 例如在香港海域找到的澄黃濱珊瑚和團(tuán)塊濱珊瑚[1]就曾被認(rèn)為是同一種。

ITS(Internal Transcribed Spacer)基因, 即內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū), 由于所受的選擇壓力較小、DNA堿基替換速率較快, 加上較大的拷貝數(shù)、適中的長度和快速的同步化等特點(diǎn), 變異速度較快, 可以提供豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)[3], 所以經(jīng)常被用于低等真核生物, 研究屬水平種間關(guān)系。在石珊瑚中, 除了鹿角珊瑚, 都可以用 ITS基因研究種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[4], Sanchez 等[5]、McFadden 等[6-8]、Forsman 等[9]分別用 ITS基因研究八放珊瑚和石珊瑚的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 本文以濱珊瑚屬的普哥濱珊瑚(Porites pukoensi), 灰黑濱珊瑚(Porites nigrescens)和澄黃濱珊瑚(Porites lutea)為研究對(duì)象, 研究徐聞3種濱珊瑚的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 以確定徐聞3種濱珊瑚種間關(guān)系。通過PCR擴(kuò)增獲得ITS序列, 利用MEGA4.1軟件對(duì)所得 ITS序列進(jìn)行比較分析, 鄰近法(NJ )構(gòu)建濱珊瑚屬的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

3種濱珊瑚樣品采自廣東省徐聞珊瑚礁國家級(jí)自然保護(hù)區(qū), 純酒精固定, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

dNTPs; PCR 緩沖液; Taq酶均購自 Takara 公司(大連), 引物由上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的制備

參照盧圣棟[10]的方法提取基因組 DNA, 4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增和序列測定

所用的引物為六放珊瑚 ITS基因通用引物[11],PCR反應(yīng)體系是25 μL, 內(nèi)含 10×Buffer(含 mg2+)2.5 μL, dNTPs 2 μL,引物各 1 μL, rTaqDNA 聚合酶 2.5 U,總DNA約100 ng。擴(kuò)增條件為： 95℃預(yù)變性4 min,94℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 循環(huán)4次, 然后94℃變性30 s, 56 ℃ 3 0 s, 72℃延伸2 min, 30個(gè)循環(huán), 最后72℃總延伸10 min。1%瓊脂糖電泳檢測, PCR產(chǎn)物直接由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用 MEGA 4.1(molecular evolution genetic analysis, Version 4.1)鄰近法(NJ ) Bootstrap重復(fù)檢測2000次構(gòu)建基于濱珊瑚的ITS1和ITS2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹,空位(gap)始終作為缺失狀態(tài), 并計(jì)算濱珊瑚屬種間的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 基于 ITS1基因的濱珊瑚屬種間遺傳距離分析和聚類分析

通過Krima2-Paramenter模式計(jì)算得到遺傳距離矩陣(表1), 用采用MEGA4.1軟件包對(duì)測序的3種濱珊瑚ITS1與GenBank的其他9種濱珊瑚ITS1進(jìn)行對(duì)位排序后做NJ聚類分析, 用kimura雙參數(shù)法計(jì)算上述12種濱珊瑚個(gè)體之間的遺傳距離, 其中濱珊瑚各種ITS1基因之間遺傳距離為0.011～0.231, 它們的平均遺傳距離是0.097。NJ聚類樹上分為3支, 徐聞3種濱珊瑚分別位于進(jìn)化樹的不同分支上, 基于ITS1基因研究徐聞 3種濱珊瑚系統(tǒng)關(guān)系時(shí), 灰黑濱珊瑚處于底部原始的位置, 較其他 2種珊瑚親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 澄黃珊瑚是過渡種, 普格濱珊瑚處于進(jìn)化樹的上端(圖1)。

2.2 基于ITS2基因的濱珊瑚種間遺傳距離分析和聚類分析

對(duì)測序3種濱珊瑚的ITS2基因與GenBank的其他9種濱珊瑚ITS2進(jìn)行對(duì)位排序后做NJ聚類分析,用kimura雙參數(shù)法計(jì)算上述12種濱珊瑚之間的遺傳距離(表 2)。ITS2基因的遺傳距離為 0～0.489, 平均遺傳距離是0.200?；贗TS2基因的NJ樹顯示徐聞的 3種濱珊瑚分別位于樹的兩大分支上, 灰黑濱珊瑚單獨(dú)作為一支位于進(jìn)化樹的基部, 澄黃濱珊瑚處于過渡位置, 普格濱珊瑚處于系統(tǒng)進(jìn)化樹的大分支上, 并且與柱狀濱珊瑚和扁縮濱珊瑚聚為一支(圖 2)。

表1 基于ITS1基因的濱珊瑚屬種間遺傳距離Tab. 1 Genetic distance among Porites Link according to ITS1 gene

3 討論

隨著環(huán)境的變化, 濱珊瑚已經(jīng)成為徐聞珊瑚礁國家級(jí)保護(hù)區(qū)內(nèi)的一大優(yōu)勢種, 明確濱珊瑚屬內(nèi)各種間的遺傳關(guān)系和分類地位對(duì)于研究整個(gè)珊瑚礁生態(tài)是舉足輕重的。本研究分別用 ITS1和ITS2基因研究了徐聞3種濱珊瑚屬的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

圖1 基于Kimura雙參數(shù)模型用檢測到的濱珊瑚ITS1序列構(gòu)建的NJ樹Fig. 1 Neighbor-joining tree topology constructed on Kimura two-parameter distance matrix using ITS1 entire region in Porites Link

表2 基于ITS2基因的濱珊瑚屬種間遺傳距離Tab. 2 Genetic distance among Porites Link according to ITS2 gene

圖2 基于Kimura雙參數(shù)模型用檢測到的濱珊瑚ITS2序列構(gòu)建的NJ樹Fig. 2 Neighbor-joining tree topology constructed on Kimura two-parameter distance matrix using ITS2 entire region in Porites Link

Nu-Wei[12]和 Chen[13]分別利用 ITS基因研究了鹿角珊瑚屬的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 認(rèn)為ITS1基因不能用于種間或者種群間的系統(tǒng)進(jìn)化分析, 而采用ITS2基因研究了鹿角珊瑚屬的系統(tǒng)發(fā)生。ITS2已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物[14-15]、動(dòng)物[16]、真菌[17-18]的分類研究中。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示基于ITS1得到的系統(tǒng)進(jìn)化樹和基于ITS2的系統(tǒng)進(jìn)化樹一致, 能夠反映出濱珊瑚各種之間的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。全球珊瑚的分布有太平洋-印度洋區(qū)系以及大西洋-加勒比海區(qū)系,無論基于 ITS1還是基于 ITS2基因的研究結(jié)果都表明, 這兩個(gè)區(qū)系的珊瑚在基因距離上不存在明顯差異。從得到進(jìn)化樹上來看, 太平洋-印度洋區(qū)系的疣濱珊瑚(Porites annae)和大西洋-加勒比海區(qū)系的Porites evermanni位于進(jìn)化樹的一支上, 太平洋-印度洋區(qū)系火焰濱珊瑚和大西洋-加勒比海區(qū)系Porites rus Porites monticulosa也始終位于進(jìn)化樹的一支上。

濱珊瑚的形態(tài)受環(huán)境影響較大, 同種珊瑚在不同的環(huán)境下, 骨骼的發(fā)育會(huì)發(fā)生很大的變化[19-21],依據(jù)于形態(tài)的濱珊瑚的分類存在著很大的不足。在形態(tài)學(xué)上, 濱珊瑚的群體形狀, 有塊狀和分枝狀的。在形態(tài)進(jìn)化上認(rèn)為分枝狀的要比塊狀的復(fù)雜。在用ITS2基因分析濱珊瑚屬時(shí), 塊狀的扁縮濱珊瑚(Porites compressa)沒有和其他的塊狀濱珊瑚聚在一支, 而是和群體分枝狀的濱珊瑚聚在一起。Verril將Porites monticulosa和Porites rus和濱珊瑚科的另一個(gè)單種屬Stylaraea作為濱珊瑚屬的一個(gè)亞屬[22], 而本文分別用ITS1和ITS2研究了Porites monticulosa和 Porites rus的分類地位, Porites monticulosa和Porites rus始終聚在一起, 表示這兩個(gè)種在濱珊瑚屬中親緣關(guān)系較近, 遺傳距離計(jì)算結(jié)果表明 Porites monticulosa和Porites annae的遺傳距離只有0.033,Porites rus和 Porites annae的的遺傳距離也只有0.033, 所以, Porites monticulosa和 Porites rus還不足以作為濱珊瑚的一個(gè)亞屬。

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Phylogeny analysis of Porites link in Xuwen using its gene

LI Wen-juan1, LIU Chu-wu1, LIU Li1, LIAO Bao-lin2
(1. Fisheries College, Guangdong Ocean University, Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal, Regular High Education Institution of Guangdong Province, Zhanjiang 524025,China; 2. Xuwen National Coral Reef Nature Reserve, Zhanjiang 524100, China)

Nov.,11, 2011

porites; ITS genes; phylogeny

The obtained ITS (internal transcribed spacer) sequences of 3 species in Porites by PCR technique were analyzed by MEGA4.1 software to get base composition, G+C content and phylogenetic relationship with ITS gene of other 9 species uploaded to Genbank, The results showed that the ranges of ITS1 and ITS2 of the tested 3 species were 205～209 bp and 197～226 bp, and the ranges of G+C content of ITS1 and ITS2 were 37.6%～45.5% and 45.1%～50.7%. The average genetic distance based on ITS1 and ITS2 were 0.097 and 0.200 respectively .The NJ-based phylogenetic tree based both ITS1 and ITS2 shows that Porites nigrescens at the base of evolutionary tree,is a primitive group, Porites pukoensis is an evolutionary group and Porites lutea is a transitional group.

Q959

A

1000-3096(2012)07-0056-05

2011-11-11;

2012-01-22

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)(A200908F01); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201105012)

李文娟(1986-), 女, 安徽亳州人, 碩士研究生, 研究方向：海洋水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)育生物學(xué), E-mail： liwenjuan8551@163.com; 劉麗, 通信作者, 副教授, 主要從事水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究, E-mail：zjouliuli@163.com

(本文編輯：梁德海)