端粒酶轉(zhuǎn)染防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)难芯?/h1>
2012-10-21 08:21:50張愈延
井岡山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) 2012年2期
張愈延
端粒酶轉(zhuǎn)染防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)难芯?/p>
張愈延1,2
（1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西，吉安 343000）
評價端粒酶轉(zhuǎn)染對角膜內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的影響。將體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細胞隨機分為3組，兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組、正常對照組和表皮生長因子組。培養(yǎng)30代后觀察傳代細胞形態(tài)和細胞周期各時相細胞比例的變化，檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達。兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)目較正常對照組和表皮生長因子組增多，伸展貼壁能力增強，表型正常，G2~M期和S期細胞比例顯著增加，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達也較正常對照組增多。兔端粒酶轉(zhuǎn)染可以促進貓角膜內(nèi)皮細胞增殖且表型正常，可以增強其伸展粘附能力和分泌功能，有利于防治角膜內(nèi)皮失代償。
端粒酶；基因轉(zhuǎn)染；角膜內(nèi)皮細胞；增殖
角膜內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的正常是維持角膜透明性的重要前提。在嬰幼兒，角膜內(nèi)皮細胞可以進行有絲分裂，但在成年后不再進行有絲分裂。當(dāng)內(nèi)皮細胞損傷后，其缺損區(qū)由鄰近的內(nèi)皮細胞增大、擴展和移行滑動來填補覆蓋。所以，隨著年齡的增長，角膜內(nèi)皮細胞的密度逐漸下降。當(dāng)角膜內(nèi)皮細胞的密度由于各種病損的作用低于某一臨界值時，發(fā)生角膜水腫和大泡性角膜病變，稱為角膜內(nèi)皮失代償。如何恢復(fù)成年人角膜內(nèi)皮細胞的有絲分裂能力以及防治角膜內(nèi)皮失代償一直是眼科界的研究熱點。本研究依據(jù)細胞衰老的端粒假說，用兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細胞為實驗?zāi)Ｐ?，探討其對貓角膜?nèi)皮細胞形態(tài)和功能的影響，以期恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細胞的有絲分裂能力，為進一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 pIRES2-增強性綠色熒光蛋白（EGFP）-rTERT正義熒光真核表達載體的構(gòu)建及鑒定
仿照文獻[1]所采用pIRES2-EGFP-人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）正義熒光真核表達載體的構(gòu)建方法和步驟操作，采用NotⅠ酶切法進行連接方向性的鑒定。
1.2 貓角膜內(nèi)皮細胞實驗室培養(yǎng)
取健康家貓新鮮眼球數(shù)只，用無菌PBS溶液沖洗干凈后，抗生素D-Hanks液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)浸泡30 min，按照參考文獻[2]所采用的方法進行實驗室培養(yǎng)，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度約100×106·L-1，每孔200 μL接種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板每6孔為1組，分為3組，分別命名為端粒酶基因轉(zhuǎn)染組（A組）、正常對照組（B組）和表皮生長因子組（C組）；A組擬進一步轉(zhuǎn)染rTERT，B組不作任何處理，C組基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入表皮生長因子，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行飽和濕度培養(yǎng)。原代貓角膜內(nèi)皮細胞培養(yǎng)36 h后換液1次。以后每2 d換液1次，備用。
1.3 rTERT導(dǎo)入原代貓角膜內(nèi)皮細胞
采用Lipofectin試劑盒，通過脂質(zhì)體法，按照試劑盒操作說明和文獻[3]所采用的hTERT轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人類胚胎成纖維細胞的操作方法，在實驗室條件下將rTERT轉(zhuǎn)染導(dǎo)入A組原代貓角膜內(nèi)皮細胞中，原培養(yǎng)條件下繼續(xù)體外培養(yǎng)。
1.4 細胞周期的流式細胞儀檢測
將轉(zhuǎn)染rTERT貓角膜內(nèi)皮細胞（A組）繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，按照參考文獻[4]所介紹的方法處理后，進行流式細胞儀檢測并分析細胞生長周期。同期、同條件下培養(yǎng)的B組和C組貓角膜內(nèi)皮細胞也按照相同操作方法進行流式細胞儀檢測分析細胞生長周期。
1.5 細胞形態(tài)學(xué)觀察
將培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細胞分別放在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化。
1.6 貓角膜內(nèi)皮細胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達
采用蛋白印跡法，對培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細胞，按照文獻[5]所述的詳細步驟操作，進行貓角膜內(nèi)皮細胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達量的檢測。當(dāng)正常貓角膜內(nèi)皮細胞、貓角膜內(nèi)皮細胞-rTERT及貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP達90 %融合時，再參照文獻[3]進行操作，擴增后分別命名為貓角膜內(nèi)皮細胞-rTERT和貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP。
1.7 統(tǒng)計學(xué)分析
2 結(jié)果
2.1 細胞形態(tài)變化
倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，A組貓角膜內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯增多，易于聚集成群，貼壁范圍較廣，細胞較大呈不規(guī)則形狀，部分呈六邊形，周邊細胞可見伸出偽足；B組貓角膜內(nèi)皮細胞較小，貼壁細胞較少，多呈圓形或橢圓形團狀；C組貓角膜內(nèi)皮細胞也見增多，但細胞多呈懸浮狀態(tài)，貼壁較少，偽足不明顯。隨著培養(yǎng)時間延長，A組、C組細胞數(shù)量較B組增多更為明顯。
2.2 細胞生長周期變化
經(jīng)單因素方差分析，與B組相比，A組、C組G0~G1期(G0：靜止期；G1：DNA合成準(zhǔn)備期)細胞比例顯著下降（< 0.05），三組間兩兩比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）；與B組相比，A組、C組G2~M期(G2：DNA合成后期；M期：有絲分裂期)細胞比例顯著提高(< 0.05)，但A組和C組G2~M期細胞比例的變化(> 0.05)在α = 0.05檢驗水準(zhǔn)上無統(tǒng)計學(xué)意義；與B組相比，A組、C組S期(S期：DNA合成期) 細胞比例顯著提高(< 0.05)，三組間兩兩比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）。
表1 兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染和表皮生長因子應(yīng)用對貓角膜內(nèi)皮細胞周期各時相細胞比例的影響
a> 0.05，A組、C組比較（單因素方差分析, SNK-檢驗）
2.3 TERT蛋白和Ⅳ型膠原表達量的變化
蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，貓角膜內(nèi)皮細胞、貓角膜內(nèi)皮細胞-rTERT、貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP中均有TERT蛋白表達，但貓角膜內(nèi)皮-rTERT細胞中TERT蛋白表達量明顯高于貓角膜內(nèi)皮細胞和貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入貓角膜內(nèi)皮細胞，并且開始有兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達。另外，貓角膜內(nèi)皮-rTERT細胞Ⅳ型膠原表達量較正常貓角膜內(nèi)皮細胞及貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP也顯著增加。
3 討論
3.1 端粒酶結(jié)構(gòu)與貓角膜內(nèi)皮細胞的研究
端粒酶是一種特殊的核糖核酸蛋白質(zhì)聚合物，是依賴RNA的DNA聚合酶。Gryfe R等于1997年提出了細胞衰老的端粒假說，即細胞衰老和永生假說，這種假說認(rèn)為細胞衰老是端粒復(fù)制問題得不到補償?shù)慕Y(jié)果，端粒的縮短是正常體細胞老化的有絲分裂鐘，當(dāng)端粒長度縮短到一定程度，即所謂的末端限制片段（TRF）的長度為5~7 kb時，就有信號指令細胞退出細胞周期，有絲分裂便不可逆地被阻斷在細胞周期的G1期和G2PM期之間的某個時期，這時的細胞便進入了老化期，隨后死亡[6]。近年來，細胞衰老的端粒假說得到越來越多的研究結(jié)果所支持，也獲得越來越多的科學(xué)家的認(rèn)可和肯定。許多研究表明體外培養(yǎng)細胞的老化加速與細胞染色體末端的端粒隨細胞分裂次數(shù)的增多而逐步縮短有關(guān)。例如有證據(jù)表明全世界第一只克隆羊多莉的過早衰老和它的細胞中染色體端粒比正常的同齡山羊的端粒短20%有關(guān)，所以有人稱多莉是“披著小羊皮的老羊”[7]。Shiels PG等研究[8]表明，生殖細胞之所以具有較強的有絲分裂能力，在于其端粒酶活性處于高活性狀態(tài)，其端粒長度長期維持在一個恒定的高水平；各種干細胞和嬰幼兒的角膜內(nèi)皮細胞，和某些動物細胞（例如兔角膜內(nèi)皮細胞）之所以保持潛在的有絲分裂能力，在于其端粒酶處于弱活性狀態(tài)；而絕大多數(shù)人類體細胞的端粒酶處于失活狀態(tài)，無法進行有絲分裂，損傷后無法增殖再生，例如成年人角膜內(nèi)皮細胞就是如此。目前眼科界普遍認(rèn)為，貓角膜內(nèi)皮細胞和成年人角膜內(nèi)皮細胞具有相同的增殖特性，失去了有絲分裂能力。由于正常成人角膜內(nèi)皮細胞不容易獲取，影響因素較多，實驗條件不容易掌控，而貓角膜內(nèi)皮細胞容易獲取，體外培養(yǎng)條件成熟，實驗容易掌控，所以本次研究動物模型選用貓角膜內(nèi)皮細胞作為實驗對象，間接探討端粒酶基因轉(zhuǎn)染對成人角膜內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。端粒酶是由三個部分構(gòu)成的，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），端粒酶RNA模板（TR）和端粒酶相關(guān)蛋白[9]。由于目前對TERT研究得較為清楚，它是端粒酶蛋白的催化亞單位，有相關(guān)研究領(lǐng)域成功經(jīng)驗可以借鑒，實驗試劑購買比較容易，所以本次研究選用TERT作為轉(zhuǎn)染基因，通過將兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染至端粒酶失活細胞——貓角膜內(nèi)皮細胞中，以期恢復(fù)或部分恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細胞的有絲分裂能力，構(gòu)建“永生化”的貓角膜內(nèi)皮細胞，為角膜組織工程提供種子細胞，并為進一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
3.2 端粒酶基因轉(zhuǎn)染與角膜內(nèi)皮細胞的生長
本研究結(jié)果顯示，貓角膜內(nèi)皮-TERT細胞中TERT蛋白表達明顯高于貓角膜內(nèi)皮細胞和貓角膜內(nèi)皮-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，表明rTERT已成功轉(zhuǎn)染至貓角膜內(nèi)皮細胞，并且開始有rTERT蛋白的表達。貓角膜內(nèi)皮細胞經(jīng)過兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染后，TERT蛋白表達量和Ⅳ型膠原表達量比正常貓角膜內(nèi)皮細胞和貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP增加，說明外源性端粒酶基因轉(zhuǎn)入后，貓角膜內(nèi)皮細胞蛋白表達功能正常，端粒酶失活抑制狀態(tài)可能得到了某種程度上的解除，預(yù)示端粒酶活性在體外培養(yǎng)條件下可以在一定程度上進行掌控，適合于基因工程研究對目的基因的要求。Ⅳ型膠原是角膜后彈力層的主要成分，主要由角膜內(nèi)皮細胞分泌，有利于角膜內(nèi)皮細胞的粘附和維持其固有的六邊形結(jié)構(gòu)，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后，貓角膜內(nèi)皮細胞分泌功能增強，有利于其伸展和粘附，縮短損傷后的修復(fù)時間，改善修復(fù)質(zhì)量，為防止角膜失代償?shù)於ɑA(chǔ)。本研究細胞周期流式細胞儀檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染兔端粒酶基因后，貓角膜內(nèi)皮S期和G2~M期細胞比例明顯增高，而G0~G1期細胞比例明顯下降，和正常對照組的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。尤其是S期細胞比例，相對于表皮生長因子組細胞也具有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)染兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶相對于表皮生長因子來說，可以促使更多的細胞進入S期，具有更強的促進細胞進行有絲分裂的能力，可以延長貓角膜內(nèi)皮細胞的生命周期，傳代數(shù)增多，延長貓角膜內(nèi)皮細胞的壽命，阻斷角膜內(nèi)皮失代償?shù)陌l(fā)病機制，防治角膜內(nèi)皮失代償。細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也說明轉(zhuǎn)染組貓角膜內(nèi)皮細胞體外相同培養(yǎng)條件下具有良好的增殖能力，數(shù)量明顯比正常對照組和表皮生長因子組增多，細胞貼壁能力增強，易于形成偽足，具有應(yīng)有的形變能力和伸展粘附能力。而且隨著傳代數(shù)的增多，觀察至30代后表型結(jié)構(gòu)正常，倒置相差顯微鏡下未發(fā)生明顯突變征象，表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染聯(lián)合實驗室培養(yǎng)可以使貓角膜內(nèi)皮細胞建立“永生化”細胞系，和端粒酶基因轉(zhuǎn)染胰島素分泌細胞研究結(jié)果類似[10]，符合角膜組織工程對種子細胞的要求，具有良好的組織工程應(yīng)用前景?？傊?，流式細胞儀和分子生物學(xué)檢測以及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果均表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后一定觀察期內(nèi)，貓角膜內(nèi)皮細胞形態(tài)正常，并且具有較強的增殖、蛋白表達、分泌和粘附功能?；蜣D(zhuǎn)染具有雙重性，端粒酶基因轉(zhuǎn)染也不另外，掌控不合理或失去掌控可能會導(dǎo)致細胞超微結(jié)構(gòu)變化和細胞無限增殖，至于兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶后會不會誘發(fā)貓角膜內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)改變和細胞無限增殖，本研究由于缺乏細胞超微結(jié)構(gòu)觀察和遠期觀察，目前無法定論，有待進一步探討。
[1] 梁光萍，羅向東，楊宗城. 端粒酶催化亞單位基因轉(zhuǎn)染對人胚胎成纖維細胞表型及壽命的影響[J]. 中國臨床康復(fù),2002,6(24):3672-3673.
[2] 羅文娟，劉關(guān)光，王傳富，等. 人血小板源性生長因子B鏈基因的克隆表達及其對貓角膜內(nèi)皮細胞體外增殖的影響[J]. 中華眼科雜志,2006,42(5):415-419.
[3] 梁光萍，羅向東，楊宗城. hTERT基因轉(zhuǎn)染對人胚胎成纖維細胞端粒長度、端粒酶活性及其亞單位的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2003,28(8):705-741.
[4] 李姝燕，吳靜，郝念，等. 層粘連蛋白和表皮生長因子對兔角膜內(nèi)皮細胞周期的影響[J].眼科新進展,2004, 24(1):9-11.
[5] 李永明，趙玉琪. 實用分子生物學(xué)方法手冊[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社,1999:366-367.
[6] Gryfe R, Swallow C, Bapat B, et al. Molecular biology of colorectal cancer[J]. Curr Probl Cancer, 1997, 21 (5): 233-300.
[7] Shiels P G, Kind A J, Campell K H, et al. Analysis of telomere lengths in cloned sheep[J]. Nature, 1999, 399:316-317.
[8] Achi M V，Ravindranath N，Dym M．Telomere length in male germ cells is inversely correlated with telomerase activity[J].Biol Reprod,2000,63(2):591-598.
[9] 馬永紅，黨榮理，任立松，等. 端粒酶的研究進展[J]. 生物技術(shù)通訊,2008(1):75-78.
[10] 任甫，侯續(xù)偉，徐國昌，等. 端粒酶轉(zhuǎn)染大鼠胰島素分泌細胞建立的永生化細胞系[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(33):6500-6504.
TELOMERASE GENE TRANSFECTION ON THE PREVENTION OF CORNEAL ENDOTHELIAL DECOMPENSATION
ZHANG Yu-yan1,2
（1.School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, jiangxi 343009, China; 2. Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000,China）
: To evaluate the effects of telomerase transfection on the morphology and function of corneal endothelial cells.：Cat corneal endothelial cells cultured in vitro were divided into 3 groups randomly, as rabbit telomerase transfection group, normal control group and epidermal growth factor group. After cultured for 30 generations, cell morphology and cell ratio changes each phase in the cycle were observed, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV was detected.：Rabbit telomerase transfection group had more cells than that in the normal control group and epidermal growth factor group, stretching adherent ability of the cells with normal phenotype was enhanced, cell ratio in M phase and S phase of G2 increased significantly, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV also increased than that of the normal control group.：Rabbit telomerase transfection can promote the proliferation of cat corneal endothelial cell with normal phenotype, can strengthen the stretching adhesion ability and secretion function, it is in favor of the treatment of corneal endothelial decompensation.
telomerase; gene transfection; corneal endothelial cell; proliferation
R772.2
A
10.3969/j.issn.1674-8085.2012.02.021
1674-8085(2012)02-0084-04
2011-12-18；
2012-02-17
張愈延(1958-)，男，江西萬安人，教授、主任醫(yī)師，主要從事角膜病、青光眼、眼表疾病等研究(E-mail: zyy8830669@sohu.com).
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張愈延
端粒酶轉(zhuǎn)染防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)难芯?/p>
張愈延1,2
（1.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西，吉安 343009；2. 井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院，江西，吉安 343000）
評價端粒酶轉(zhuǎn)染對角膜內(nèi)皮細胞形態(tài)和功能的影響。將體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細胞隨機分為3組，兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組、正常對照組和表皮生長因子組。培養(yǎng)30代后觀察傳代細胞形態(tài)和細胞周期各時相細胞比例的變化，檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達。兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)目較正常對照組和表皮生長因子組增多，伸展貼壁能力增強，表型正常，G2~M期和S期細胞比例顯著增加，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白和Ⅳ型膠原的表達也較正常對照組增多。兔端粒酶轉(zhuǎn)染可以促進貓角膜內(nèi)皮細胞增殖且表型正常，可以增強其伸展粘附能力和分泌功能，有利于防治角膜內(nèi)皮失代償。
端粒酶；基因轉(zhuǎn)染；角膜內(nèi)皮細胞；增殖
角膜內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的正常是維持角膜透明性的重要前提。在嬰幼兒，角膜內(nèi)皮細胞可以進行有絲分裂，但在成年后不再進行有絲分裂。當(dāng)內(nèi)皮細胞損傷后，其缺損區(qū)由鄰近的內(nèi)皮細胞增大、擴展和移行滑動來填補覆蓋。所以，隨著年齡的增長，角膜內(nèi)皮細胞的密度逐漸下降。當(dāng)角膜內(nèi)皮細胞的密度由于各種病損的作用低于某一臨界值時，發(fā)生角膜水腫和大泡性角膜病變，稱為角膜內(nèi)皮失代償。如何恢復(fù)成年人角膜內(nèi)皮細胞的有絲分裂能力以及防治角膜內(nèi)皮失代償一直是眼科界的研究熱點。本研究依據(jù)細胞衰老的端粒假說，用兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細胞為實驗?zāi)Ｐ?，探討其對貓角膜?nèi)皮細胞形態(tài)和功能的影響，以期恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細胞的有絲分裂能力，為進一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 pIRES2-增強性綠色熒光蛋白（EGFP）-rTERT正義熒光真核表達載體的構(gòu)建及鑒定
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1.2 貓角膜內(nèi)皮細胞實驗室培養(yǎng)
取健康家貓新鮮眼球數(shù)只，用無菌PBS溶液沖洗干凈后，抗生素D-Hanks液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)浸泡30 min，按照參考文獻[2]所采用的方法進行實驗室培養(yǎng)，制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度約100×106·L-1，每孔200 μL接種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板每6孔為1組，分為3組，分別命名為端粒酶基因轉(zhuǎn)染組（A組）、正常對照組（B組）和表皮生長因子組（C組）；A組擬進一步轉(zhuǎn)染rTERT，B組不作任何處理，C組基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入表皮生長因子，放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行飽和濕度培養(yǎng)。原代貓角膜內(nèi)皮細胞培養(yǎng)36 h后換液1次。以后每2 d換液1次，備用。
1.3 rTERT導(dǎo)入原代貓角膜內(nèi)皮細胞
采用Lipofectin試劑盒，通過脂質(zhì)體法，按照試劑盒操作說明和文獻[3]所采用的hTERT轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的人類胚胎成纖維細胞的操作方法，在實驗室條件下將rTERT轉(zhuǎn)染導(dǎo)入A組原代貓角膜內(nèi)皮細胞中，原培養(yǎng)條件下繼續(xù)體外培養(yǎng)。
1.4 細胞周期的流式細胞儀檢測
將轉(zhuǎn)染rTERT貓角膜內(nèi)皮細胞（A組）繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，按照參考文獻[4]所介紹的方法處理后，進行流式細胞儀檢測并分析細胞生長周期。同期、同條件下培養(yǎng)的B組和C組貓角膜內(nèi)皮細胞也按照相同操作方法進行流式細胞儀檢測分析細胞生長周期。
1.5 細胞形態(tài)學(xué)觀察
將培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細胞分別放在倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化。
1.6 貓角膜內(nèi)皮細胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達
采用蛋白印跡法，對培養(yǎng)至30代A組、B組和C組角膜內(nèi)皮細胞，按照文獻[5]所述的詳細步驟操作，進行貓角膜內(nèi)皮細胞外源性rTERT蛋白和Ⅳ型膠原的表達量的檢測。當(dāng)正常貓角膜內(nèi)皮細胞、貓角膜內(nèi)皮細胞-rTERT及貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP達90 %融合時，再參照文獻[3]進行操作，擴增后分別命名為貓角膜內(nèi)皮細胞-rTERT和貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP。
1.7 統(tǒng)計學(xué)分析
2 結(jié)果
2.1 細胞形態(tài)變化
倒置相差顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，A組貓角膜內(nèi)皮細胞數(shù)量明顯增多，易于聚集成群，貼壁范圍較廣，細胞較大呈不規(guī)則形狀，部分呈六邊形，周邊細胞可見伸出偽足；B組貓角膜內(nèi)皮細胞較小，貼壁細胞較少，多呈圓形或橢圓形團狀；C組貓角膜內(nèi)皮細胞也見增多，但細胞多呈懸浮狀態(tài)，貼壁較少，偽足不明顯。隨著培養(yǎng)時間延長，A組、C組細胞數(shù)量較B組增多更為明顯。
2.2 細胞生長周期變化
經(jīng)單因素方差分析，與B組相比，A組、C組G0~G1期(G0：靜止期；G1：DNA合成準(zhǔn)備期)細胞比例顯著下降（< 0.05），三組間兩兩比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）；與B組相比，A組、C組G2~M期(G2：DNA合成后期；M期：有絲分裂期)細胞比例顯著提高(< 0.05)，但A組和C組G2~M期細胞比例的變化(> 0.05)在α = 0.05檢驗水準(zhǔn)上無統(tǒng)計學(xué)意義；與B組相比，A組、C組S期(S期：DNA合成期) 細胞比例顯著提高(< 0.05)，三組間兩兩比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）。
表1 兔端粒酶基因轉(zhuǎn)染和表皮生長因子應(yīng)用對貓角膜內(nèi)皮細胞周期各時相細胞比例的影響
a> 0.05，A組、C組比較（單因素方差分析, SNK-檢驗）
2.3 TERT蛋白和Ⅳ型膠原表達量的變化
蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，貓角膜內(nèi)皮細胞、貓角膜內(nèi)皮細胞-rTERT、貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP中均有TERT蛋白表達，但貓角膜內(nèi)皮-rTERT細胞中TERT蛋白表達量明顯高于貓角膜內(nèi)皮細胞和貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入貓角膜內(nèi)皮細胞，并且開始有兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白的表達。另外，貓角膜內(nèi)皮-rTERT細胞Ⅳ型膠原表達量較正常貓角膜內(nèi)皮細胞及貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP也顯著增加。
3 討論
3.1 端粒酶結(jié)構(gòu)與貓角膜內(nèi)皮細胞的研究
端粒酶是一種特殊的核糖核酸蛋白質(zhì)聚合物，是依賴RNA的DNA聚合酶。Gryfe R等于1997年提出了細胞衰老的端粒假說，即細胞衰老和永生假說，這種假說認(rèn)為細胞衰老是端粒復(fù)制問題得不到補償?shù)慕Y(jié)果，端粒的縮短是正常體細胞老化的有絲分裂鐘，當(dāng)端粒長度縮短到一定程度，即所謂的末端限制片段（TRF）的長度為5~7 kb時，就有信號指令細胞退出細胞周期，有絲分裂便不可逆地被阻斷在細胞周期的G1期和G2PM期之間的某個時期，這時的細胞便進入了老化期，隨后死亡[6]。近年來，細胞衰老的端粒假說得到越來越多的研究結(jié)果所支持，也獲得越來越多的科學(xué)家的認(rèn)可和肯定。許多研究表明體外培養(yǎng)細胞的老化加速與細胞染色體末端的端粒隨細胞分裂次數(shù)的增多而逐步縮短有關(guān)。例如有證據(jù)表明全世界第一只克隆羊多莉的過早衰老和它的細胞中染色體端粒比正常的同齡山羊的端粒短20%有關(guān)，所以有人稱多莉是“披著小羊皮的老羊”[7]。Shiels PG等研究[8]表明，生殖細胞之所以具有較強的有絲分裂能力，在于其端粒酶活性處于高活性狀態(tài)，其端粒長度長期維持在一個恒定的高水平；各種干細胞和嬰幼兒的角膜內(nèi)皮細胞，和某些動物細胞（例如兔角膜內(nèi)皮細胞）之所以保持潛在的有絲分裂能力，在于其端粒酶處于弱活性狀態(tài)；而絕大多數(shù)人類體細胞的端粒酶處于失活狀態(tài)，無法進行有絲分裂，損傷后無法增殖再生，例如成年人角膜內(nèi)皮細胞就是如此。目前眼科界普遍認(rèn)為，貓角膜內(nèi)皮細胞和成年人角膜內(nèi)皮細胞具有相同的增殖特性，失去了有絲分裂能力。由于正常成人角膜內(nèi)皮細胞不容易獲取，影響因素較多，實驗條件不容易掌控，而貓角膜內(nèi)皮細胞容易獲取，體外培養(yǎng)條件成熟，實驗容易掌控，所以本次研究動物模型選用貓角膜內(nèi)皮細胞作為實驗對象，間接探討端粒酶基因轉(zhuǎn)染對成人角膜內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。端粒酶是由三個部分構(gòu)成的，即端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），端粒酶RNA模板（TR）和端粒酶相關(guān)蛋白[9]。由于目前對TERT研究得較為清楚，它是端粒酶蛋白的催化亞單位，有相關(guān)研究領(lǐng)域成功經(jīng)驗可以借鑒，實驗試劑購買比較容易，所以本次研究選用TERT作為轉(zhuǎn)染基因，通過將兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（rTERT）轉(zhuǎn)染至端粒酶失活細胞——貓角膜內(nèi)皮細胞中，以期恢復(fù)或部分恢復(fù)貓角膜內(nèi)皮細胞的有絲分裂能力，構(gòu)建“永生化”的貓角膜內(nèi)皮細胞，為角膜組織工程提供種子細胞，并為進一步防治角膜內(nèi)皮失代償?shù)於ɑA(chǔ)。
3.2 端粒酶基因轉(zhuǎn)染與角膜內(nèi)皮細胞的生長
本研究結(jié)果顯示，貓角膜內(nèi)皮-TERT細胞中TERT蛋白表達明顯高于貓角膜內(nèi)皮細胞和貓角膜內(nèi)皮-EGFP，而且部分為rTERT蛋白，表明rTERT已成功轉(zhuǎn)染至貓角膜內(nèi)皮細胞，并且開始有rTERT蛋白的表達。貓角膜內(nèi)皮細胞經(jīng)過兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染后，TERT蛋白表達量和Ⅳ型膠原表達量比正常貓角膜內(nèi)皮細胞和貓角膜內(nèi)皮細胞-EGFP增加，說明外源性端粒酶基因轉(zhuǎn)入后，貓角膜內(nèi)皮細胞蛋白表達功能正常，端粒酶失活抑制狀態(tài)可能得到了某種程度上的解除，預(yù)示端粒酶活性在體外培養(yǎng)條件下可以在一定程度上進行掌控，適合于基因工程研究對目的基因的要求。Ⅳ型膠原是角膜后彈力層的主要成分，主要由角膜內(nèi)皮細胞分泌，有利于角膜內(nèi)皮細胞的粘附和維持其固有的六邊形結(jié)構(gòu)，說明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后，貓角膜內(nèi)皮細胞分泌功能增強，有利于其伸展和粘附，縮短損傷后的修復(fù)時間，改善修復(fù)質(zhì)量，為防止角膜失代償?shù)於ɑA(chǔ)。本研究細胞周期流式細胞儀檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染兔端粒酶基因后，貓角膜內(nèi)皮S期和G2~M期細胞比例明顯增高，而G0~G1期細胞比例明顯下降，和正常對照組的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。尤其是S期細胞比例，相對于表皮生長因子組細胞也具有顯著性差異，說明轉(zhuǎn)染兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶相對于表皮生長因子來說，可以促使更多的細胞進入S期，具有更強的促進細胞進行有絲分裂的能力，可以延長貓角膜內(nèi)皮細胞的生命周期，傳代數(shù)增多，延長貓角膜內(nèi)皮細胞的壽命，阻斷角膜內(nèi)皮失代償?shù)陌l(fā)病機制，防治角膜內(nèi)皮失代償。細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果也說明轉(zhuǎn)染組貓角膜內(nèi)皮細胞體外相同培養(yǎng)條件下具有良好的增殖能力，數(shù)量明顯比正常對照組和表皮生長因子組增多，細胞貼壁能力增強，易于形成偽足，具有應(yīng)有的形變能力和伸展粘附能力。而且隨著傳代數(shù)的增多，觀察至30代后表型結(jié)構(gòu)正常，倒置相差顯微鏡下未發(fā)生明顯突變征象，表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染聯(lián)合實驗室培養(yǎng)可以使貓角膜內(nèi)皮細胞建立“永生化”細胞系，和端粒酶基因轉(zhuǎn)染胰島素分泌細胞研究結(jié)果類似[10]，符合角膜組織工程對種子細胞的要求，具有良好的組織工程應(yīng)用前景?？傊?，流式細胞儀和分子生物學(xué)檢測以及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果均表明兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入后一定觀察期內(nèi)，貓角膜內(nèi)皮細胞形態(tài)正常，并且具有較強的增殖、蛋白表達、分泌和粘附功能?；蜣D(zhuǎn)染具有雙重性，端粒酶基因轉(zhuǎn)染也不另外，掌控不合理或失去掌控可能會導(dǎo)致細胞超微結(jié)構(gòu)變化和細胞無限增殖，至于兔端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶后會不會誘發(fā)貓角膜內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)改變和細胞無限增殖，本研究由于缺乏細胞超微結(jié)構(gòu)觀察和遠期觀察，目前無法定論，有待進一步探討。
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TELOMERASE GENE TRANSFECTION ON THE PREVENTION OF CORNEAL ENDOTHELIAL DECOMPENSATION
ZHANG Yu-yan1,2
（1.School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, jiangxi 343009, China; 2. Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000,China）
: To evaluate the effects of telomerase transfection on the morphology and function of corneal endothelial cells.：Cat corneal endothelial cells cultured in vitro were divided into 3 groups randomly, as rabbit telomerase transfection group, normal control group and epidermal growth factor group. After cultured for 30 generations, cell morphology and cell ratio changes each phase in the cycle were observed, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV was detected.：Rabbit telomerase transfection group had more cells than that in the normal control group and epidermal growth factor group, stretching adherent ability of the cells with normal phenotype was enhanced, cell ratio in M phase and S phase of G2 increased significantly, the expression of telomerase reverse transcriptase protein and collagen IV also increased than that of the normal control group.：Rabbit telomerase transfection can promote the proliferation of cat corneal endothelial cell with normal phenotype, can strengthen the stretching adhesion ability and secretion function, it is in favor of the treatment of corneal endothelial decompensation.
telomerase; gene transfection; corneal endothelial cell; proliferation
R772.2
A
10.3969/j.issn.1674-8085.2012.02.021
1674-8085(2012)02-0084-04
2011-12-18；
2012-02-17
張愈延(1958-)，男，江西萬安人，教授、主任醫(yī)師，主要從事角膜病、青光眼、眼表疾病等研究(E-mail: zyy8830669@sohu.com).
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