王李寶，沈 輝，凌 云，黎 慧，萬夕和，鐘 非，張朝暉

（江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇南通 226007）

沉積物是各種海洋污染物的源和匯，隨著海洋污染的加劇，沉積物中的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、重金屬、硫化物等的含量逐漸增加，不但危害底棲生物的生存環(huán)境和水產(chǎn)品質(zhì)量，而且容易造成水體的二次污染，這種情況在海水養(yǎng)殖池塘里表現(xiàn)得尤為突出[1]。因此，去除沉積環(huán)境中的污染物，或?qū)κ芪廴镜某练e環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)，是維持海水養(yǎng)殖健康發(fā)展的有效手段。

迄今為止，已報(bào)道的自然界中有關(guān)氧化硫化物的微生物主要有絲狀硫細(xì)菌、光合硫細(xì)菌和無色硫細(xì)菌[2]，其中脫硫桿菌屬Thiobacillus的8種桿菌能在厭氧條件下，利用硝酸鹽為電子受體同步去除硫化物[3]。由于以上脫硫微生物作為自養(yǎng)菌耐有機(jī)負(fù)荷的能力相對(duì)均較弱，且同步脫氮脫硫理論目前絕大部分是應(yīng)用在工業(yè)領(lǐng)域。本研究從異養(yǎng)硝化細(xì)菌中分離得到一株脫硫細(xì)菌NG6-3，并從形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)方面對(duì)該菌進(jìn)行了初步研究，為今后利用該菌株對(duì)沉積物環(huán)境中硫化物進(jìn)行生物降解奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 硫化物氧化細(xì)菌的篩選和形態(tài)觀察

1.1.1 沉積物樣品

啟東呂四鎮(zhèn)某海水養(yǎng)殖池塘，多年蝦蟹混養(yǎng)池，離池底液面5～10 cm的暗黑色泥樣。

1.1.2 分離和篩選培養(yǎng)基

1.1.2.1 分離培養(yǎng)基

采用普通的2116E培養(yǎng)基。

1.1.2.2 篩選培養(yǎng)基

（NH4）2SO40.5 g，蔗糖 5.00 g ，牛肉膏 1.00 g，Na2S 飽和液 1.5 mL，1 000 mL 陳海水，pH 7.6～7.8。

1.1.3 分離和篩選步驟

1.1.3.1 異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離

按彭光浩等[4]方法，采用稀釋平板法分離得到菌株，并在平板上用格里斯（Griess）試劑直接點(diǎn)滴判定硝化活性，選取硝化活性較強(qiáng)者在分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，作為脫硫細(xì)菌篩選的供試菌株。得純菌113株。

1.1.3.2 脫硫細(xì)菌的篩選

將上述純133株菌株分別接至2116E培養(yǎng)基（不含瓊脂）中，37℃培養(yǎng)24 h，再按2%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接至篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，適時(shí)測定培養(yǎng)基中硫化物含量，以篩選出具有硫化物降解能力的菌株。在113株菌株中篩選得到一株具有較強(qiáng)硫化物降解能力的菌株，編號(hào)NG6-3，用于后續(xù)研究。

1.2 細(xì)菌初步鑒定

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

將菌株NG6-3在分離培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，在光學(xué)顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、鞭毛形態(tài)及芽孢形態(tài)[5]。

1.2.2 生理生化檢查

取純培養(yǎng)的菌株NG6-3，分別接種于細(xì)菌生化特性鑒定用培養(yǎng)基中，按常規(guī)進(jìn)行氧化酶、接觸酶、糖（醇及苷）類代謝、H2S、吲哚、MR（V-P）試驗(yàn)、硝酸鹽還原、枸櫞酸鹽利用等，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]進(jìn)行。并結(jié)合API－32E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)的生化反應(yīng)結(jié)果，對(duì)NG6-3的種屬進(jìn)行初步判定[6]。

1.2.3 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

1.2.3.1 菌株NG6-3基因組DNA的提取

取對(duì)數(shù)培養(yǎng)期的菌懸液1.5 mL，采用酚－氯仿法提取細(xì)菌DNA[7-8]。加100 μL TE溶液溶解。

1.2.3.2 菌株NG6-3部分序列分析

以提取的DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物（正向27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向1495R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，)進(jìn)行 16S rRNA 基因擴(kuò)增。反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s；52℃退火l min 30 s；72℃延伸l min 30s；30個(gè)循環(huán)，延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測純化后，由上海生物工程技術(shù)公司進(jìn)行基因測序。

對(duì)供試菌株NG6-3基因序列通過NCBI（NCBI菌株提交號(hào)EU081880.1）的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，并用MEGA4.1軟件與從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進(jìn)行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用鄰接法（neighbor joining method）獲得分支系統(tǒng)樹，并通過Bootstrap法（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)。

1.2.4 菌種分類位置的確定

根據(jù)供試菌株形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測定的結(jié)果，主要依據(jù)《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.9thed》[9]、《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[10]及相關(guān)資料，進(jìn)行種屬分類位置判定。

1.3 安全性試驗(yàn)

設(shè)待測菌株、陽性對(duì)照菌和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)2個(gè)平行，每個(gè)平行隨機(jī)選取暫養(yǎng)7 d的健康凡納濱對(duì)蝦50尾；每尾注射待測菌株、陽性對(duì)照菌和陰性對(duì)照50 μL，每天記錄其死亡情況。陽性對(duì)照為鰻弧菌，陰性對(duì)照為不接種處理。每株菌用107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL和104cfu/mL 4個(gè)濃度進(jìn)行肌肉注射。

1.4 脫硫效果的初步驗(yàn)證

取50 mL以硫化鈉作為惟一硫源的液體培養(yǎng)基于250 mL的錐形瓶中，接種1 mL處于對(duì)數(shù)生長期的供試菌液，以沒有接種菌液的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。調(diào)節(jié)初始pH為7.8，在30℃，靜置培養(yǎng)，定期測定菌體生長量及培養(yǎng)基中硫化物質(zhì)量濃度。硫化物的測定采用碘量法[11]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株NG6-3的鑒定結(jié)果

2.1.1 供試菌株的分離和形態(tài)學(xué)觀察

從上述泥樣分離純化得到一株具有氨氧化能力和脫硫能力的菌株，命名為NG6-3。菌株NG6-3在2116E培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后形成直徑為1.5 mm、乳白色、邊緣整齊的細(xì)小菌落，圓形，表面濕潤，光滑，呈蠟狀（圖1）。在1 000倍光學(xué)顯微鏡下觀察，菌株NG6-3革蘭氏陰性，細(xì)胞為橢圓形，無芽孢，細(xì)胞大小為 0.5～1.0 μm×1.0～2.0 μm（圖 2）。

進(jìn)一步對(duì)菌株NG6-3做磷酸鎢負(fù)染，透射電鏡下觀察呈短桿狀，無鞭毛（圖3）。

圖1 NG6-3的菌落形態(tài)Fig.1 The colony of strain NG6-3

圖2 NG6-3的顯微形態(tài)Fig.2 The morphology of strain NG6-3

2.1.2 理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

供試菌株NG6-3在法國梅里埃公司API-32E系統(tǒng)生化反應(yīng)結(jié)果見表，相應(yīng)的軟件進(jìn)行供試菌株的所屬分析表明與弧菌屬的相似性較高（98%）。其中鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、L-阿拉伯糖醇、酚紅、吲哚產(chǎn)生、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖反應(yīng)呈陽性，主要的生化反應(yīng)結(jié)果見表1。

2.1.3 16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

利用細(xì)菌通用引物，對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增并測序，得到序列長度為957 bp（GenBank登錄號(hào)為EU081880）。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，該菌株與弧菌屬中部分菌株（CP001805.1）的相似性為99%，其在系統(tǒng)分類中位置如圖4所示。有關(guān)弧菌屬的細(xì)菌能夠在海水環(huán)境中同步去除硫化物和銨態(tài)氮的研究在國內(nèi)外還未見報(bào)道。

2.2 菌株NG6-3的安全性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 菌株NG6-3的電鏡照片F(xiàn)ig.3 Electronic micrograph of the isolated strain NG6-3

圖4 根據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

表1 菌株NG6－3的API32E生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．1 Bio－chemical characteristics of strain NG6－3 by API32E test

注射待測菌，生理鹽水和陽性對(duì)照后，每天記錄死亡數(shù)，計(jì)算其累積死亡率，用SPSS17．0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2。

表2 NG6－3安全性試驗(yàn)中各組凡納濱對(duì)蝦的累積死亡率（%）Tab．2 The cumulative mortality of Litopenaeus vannamei in safety test(%)

NG6－3 的 107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL 和 104cfu/mL注射組與生理鹽水注射組在觀察的兩周時(shí)間內(nèi)均無死亡現(xiàn)象；而陽性對(duì)照鰻弧菌的107cfu/mL和106cfu/mL注射組均引起對(duì)蝦大量死亡，顯著高于其他注射組（P＜0．05）。由此可知，NG6－3 對(duì)凡納濱對(duì)蝦無毒害作用。

2．3 菌株NG6－3脫硫效果的初步研究

接種有供試菌NG6－3的培養(yǎng)基中硫化物含量第2天就為對(duì)照組的44．3%，第5天開始，在培養(yǎng)基中幾乎測不到硫化物的存在，隨著硫化物含量的降低菌株生長量逐漸增大（圖5）。

圖5 菌株NG6－3的硫化物出去除效果Fig．5 The removal effect of sulfide based on strain NG6－3

3 討論

目前報(bào)道的具有硫化物氧化能力的微生物有蝕陰溝硫桿菌Thiobacillus concretivorus[12]、酒色著色菌Chromatium vinosum[13]、氧化亞鐵硫桿菌 Thiobacillus ferrooxidans[13]、氧化硫硫桿菌 Thiobacillus thiooxidans[15]、排硫桿菌 Thiobacillus thioparus[16]、鏈霉菌 Streptomyces sp．strainSH91[17]和弓形菌 Arcobacter sp．[18]等?；【诤Ｋ蟹植紡V泛，是海水環(huán)境中的常見細(xì)菌，部分弧菌在一定條件下可導(dǎo)致海水養(yǎng)殖對(duì)象致病[19]?；【诤Ｋh(huán)境中長期存在，對(duì)環(huán)境中的各種營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生了依賴作用，可以利用環(huán)境中的不同物質(zhì)作為營養(yǎng)而生存?；【鷮賄ibrio的哈氏弧菌Vibrio harveyi、費(fèi)氏弧菌Vibrio fisher早期曾經(jīng)均被作為發(fā)光細(xì)菌用于在水環(huán)境污染物的檢測，后并被證實(shí)多種弧菌均為非致病菌[20]。本研究中分離得到一株既能利用Na2S，又能進(jìn)行氨氧化作用的細(xì)菌，并結(jié)合了初步的安全性試驗(yàn)，排除了其潛在的致病性。對(duì)擴(kuò)大海水養(yǎng)殖環(huán)境改良菌的篩選范圍，提供了一個(gè)大膽的思路。

早在上世紀(jì)，BISOGNI等[21]利用富集培養(yǎng)的脫氮硫桿菌以硫代硫酸鹽和硫化物為電子供體進(jìn)行了小試的自養(yǎng)反硝化研究，表明脫氮硫桿菌是典型的能夠同時(shí)利用硫化物和硝酸鹽的細(xì)菌。同步去除氨氮和硫化物的研究最早集中在制藥廢水、食品發(fā)酵廢水、造紙廢水等工業(yè)廢水的處理中，將其方法借用到水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境修復(fù)應(yīng)用中來，也不失為一種捷徑。本研究就是基于此理論基礎(chǔ)，先分離出一株具有較強(qiáng)能力的異養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌，在此基礎(chǔ)上在分離出一株能利用Na2S的細(xì)菌，以期在同一環(huán)境中實(shí)現(xiàn)對(duì)氨氮和硫化物的同步去除作用。

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